Parte 5 -
Secuenciando el ADN
En la última etapa tenemos 12
tubos que contienen el producto final de la PCR, una mezcla de pedazos de
ADN de longitud variable. Todos los ADN en cada tubo comienzan con el
mismo primer pero finalizan con un nucleótido diferente con un marcador
fluorescente (con un color diferente para cada nucleótido
A, T, G y C ). El trabajo que queda es separar las piezas individuales de
ADN e identificar el nucleótido final.
Esto se realiza utilizando un secuenciador automático que realiza la
electroforésis el gel del ADN de cada tubo. La electroforésis en gel es
un método que permite separar moléculas basadas en diferencias de
tamaño. En este ejemplo el secuenciador posee un fino tubo capilar
insertado en el extremo de un mecanismo tipo jeringa con buffer en su
interior. El tubo se llena con el buffer y su otro extremo se inserta en
uno de los tubos que contienen las piezas de ADN. Se aplica corriente
eléctrica en manera tal que el extremo del tubo en contacto con el ADN
tenga carga negativa y la jeringa carga positiva. Dado que el ADN se
encuentra cargado negativamente se mueve a lo largo del tubo en dirección
del extremo positivo (la jeringa). Los pedazos de menor tamaño obviamente
se mueven mas rápido que los mas grandes. Cerca del extremo el tubo
capilar pasa por un rayo láser que excita a los marcadores fluorescentes y
detectores ópticos determinan el color de la fluorescencia.
Podemos asumir que en un conjunto de pedazos de ADN (generados en la etapa
anterior) tenemos todos los diferentes tamaños, que se diferencian
correlativamente exactamente en un nucleótido. La menor pieza que
contiene una marca fluorescente corresponde al nucleótido adyacente al primer
. Este fragmento de ADN correrá mas rápido que los otros, leyendo el
color de la fluorescencia (ROJA) se determina (en el ejemplo) que el
primer nucleótido y la base es timidina (T), la próxima pieza fluoresce
en verde y determina que la base es adenina (A) así, a medida que pasan
frente al rayo láser, se reconstruye la secuencia de bases del ADN (1) y
(2).
El secuenciador automáticamente elimina el buffer se mueve al otro tubo,
repite el procedimiento y asi sucesivamente con los 12 tubos. Un
programa de computación colecta los resultados y reconstituye la
secuencia completa del ADN correspondiente al gen del ARNr 16S.
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