HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE LA BIOLOGÍA

 ARN de Interferencia

Basado esencialmente  en : The New England Journal of Medicine,Volume 347:1364-1367, Volume 347:1364-1367, Number 17

¿Como se desarrollan los tomates?, ¿que determina el color de los ojos de un insecto? y ¿como se bloquea el VIH?  son cuestiones muy diferentes, sin embargo los genetistas moleculares convergieron en una misma herramienta molecular para encontrar las respuestas: el siARN (short interfering ARN) o ARN corto de interferencia.

El siARN es la clave de una  tecnología nueva que promete un gran desarrollo en estas áreas y provee un mecanismo simple por medio del cual los investigadores (y quizás los médicos, en un futuro cercano....) pueden "prender" y "apagar" los genes, segun deseen.

Los siRNAs son componentes de una gran respuesta antiviral denominada interferencia del ARN, una defensa celular descubierta en plantas y gusanos. Ciertos virus estan compuestos por ARN de doble cadena y, la presencia de tan obvio ARN ajeno a la célula desencadena (en plantas e invertebrados),  una respuesta liderada por la enzima "DICER" ("cubeteadora"?), que corta el ARN invasor en pequeños pedazos. Otras proteínas forman el RISC (RNA-Induced Silencing Complex, Complejo silenciador inducido por ARN). 
El RISC separa las piezas de ARN y las usa como guía para buscar y aparearse (o "silenciar") toda secuencia de ARN que coincida con ellas. Al bloquear este ARN, la célula se asegura que no se sinteticen proteínas virales

  Numerosos grupos han puesto su mira en el mARN del HIV y en propio genoma viral señalando que puede ser degradado por iARN.2,3,4  
El iARN es la clave de un mecanismo general de "silenciación" de la transcripción de genes activos.
Este proceso de "silenciación" post-transcripciónal es iniciado por  el siARN (short interfering ARN, ARN de interferencia corto), un  forma en doble cadena del ARN que contiene de 21 a 23 pb, y es altamente específico para la secuencia "blanco" (target) de un ARN mensajero.5,6  
En plantas y en las células de Drosophila, el siRNAs es generado por  la DICER ( una endonuclesa7  que fragmenta moléculas largas de ARN a doble cadena en fragmentos de 21 to 23 pb.7,8,9  Este siARN se asocia con moléculas de helicasas y nucleasas para formar un complejo denominado RISC (RNA-Induced Silencing Complex, Complejo silenciador inducido por ARN), que desdobla el siARN y dirige la degradación precisa  (secuencia-específica) de un ARN mensajero  (Figura 1).

Figura 1.  Silenciamiento Post-Transcripcional de un Gen, Iniciado por siARN.

El siRNA interacciona con la helicasa (círculo púrpura) y la nucleasa (óvalo rosado) y forma un complejo denominado RISC (RNA-induced silencing complex, Complejo silenciador inducido por ARN) (1). La Helicasa del RISC usa  ATP para desdoblar el siARN, permitiendo que la  cadena antisentido (cadena corta en azul) se complemente con su "blanco" en el ARN mensajero (ARNm, cadena larga en rojo) (2). La nucleasa del RISC corta el ARNm  (3), que finalmente es rapidamente degradado por otras ARNasas (4).
En plantas y en Drosophila, DICER, un complejo que contiene una endonuclesa con actividad de helicasa y quinasa (óvalo verde) y una ARN dependiente, ARN polimerasa ( P roja en el triángulo verde), amplifica el siARN.
bulletDICER degrada el ARN de doble cadena para generar siARN(5), el cual puede formar RISCs (1).
bulletEl nuevo  siRNA puede también asociarse con DICER y ARN mensajero  (6)
bulletLuego de desdoblarlo, la cadena antisentido del siARN actúa como cebador ( primer ) para la síntesis de ARN de doble cadena usando como molde (template) el ARN mensajero y como enzima la polimerasa del DICER (7). 
bulletLas etapas 5, 6, y 7 conforman un lazo de amplificación.
 No se ha encontrado DICER en células diferenciadas de mamíferos, sin embargo, en dichas células la presencia de ARN doble cadena de mas de 30 pb induce la síntesis de interferón, el cual desencadena la degradación inespecífica del ARN y la inhibición de la síntesis proteica 10 . Por esta razón las intervenciones convencionales con blanco a un ARN en las células diferenciadas  de mamíferos se basaron en el uso de ARN antisentido y ribozimas11 . 

Sin embargo recientemente se encontró que la transfección de células de mamíferos con siARN sintético desencadena fenómenos de interferencia del ARN , secuencia específicos12 . Esto indica que el  mecanismo mediado por DICER no es esencial para que estas células formen complejos RISC. (Figura 1).
 La interferencia del ARNm se ha convertido  rapidamente en un arma para un ataque multifrontal contra el VIH. Tres grupos han diseñado  siARN contra el virus2,3,4  y blancos celulares2 a diferentes etapas del ciclo del HIV.
  In vitro, el ARN viral del complejo post entrada (donde se forma ADN a partir del templado de ese ARN) fue degrado y la integración del ADN proviral fue abolida cuando, antes de la infección, se introducia siARNs contra varias regiones del genoma viral3 (Figura 2). Un descubrimiento importante fue encontrar que es necesario un alto grado de especificidad del siARN, para con la secuencia blanco, a fin de lograr el efecto. El cambio de 1pb del siARN reduce dramaticamente la degradación del ARN del VIH.

Figura 2. El ciclo del VHI y el ARN de interferencia

La entrada del VIH  (en azul) en la célula comienza cuando el complejo trimérico gp120 (en amarillo) interacciona con el receptor CD4 (en marrón) en la superficie celular (1). El gp120 que se pega al CD4 expone el dominio que se pega al correceptor de quimiciona. Esto permite al complejo gp120-CD4 pegarse al  correceptor (CCR5, en violeta). Otros cambios conformacionales inducen la fusión (mediada por la gp41) de la envoltura viral con la membrana celular  (2). El complejo post-entrada del VHI (en rojo) penetra en el citoplasma  (3). El ARN viral del (ahora) complejo de preintegración puede ser el blanco de un complejo silenciador virus específico ARN inducido, o vRISCs ( del inglés: virus-specific RNA-induced silencing complexes, Complejo silenciador inducido por ARN, virus específico) (4). Si no existe vRISCs  durante la entrada del virus (o esta en cantidad insuficiente), el provirus (en rojo) se integra al genoma celular (negro). 

Ahora la activación celular puede dar lugar  a la transcripción viral (cadenas rojas) (5a). El ARN viral es transportado al citoplasma y ahora el vRISCs puede interaccionar con el ARN viral previniendo su traducción, la reorganización viral y la subsecuente salida. (6a). 
Por otra parte los genes celulares pueden ser transcriptos a ARN mensajero (cadenas verdes) (5b) y pasar al citoplasma, obviamente, el ARN mensajero del CCR5 sigue el mismo camino. Un complejo  RISCs que tenga como blanco el ARN mensajero del CCR5  lo degrada e impide la expresión en la superficie celular  del correceptor CCR5 (6b).


El gen gag del VHI se expresa en las últimas etapas de la replicación del VHI  y codifica para la la proteína precursora Gag, la cual es cortada proteolíticamente en p24 y otros polipéptidos. La  p24 forma el core del VHI e interviene en el empaquetamiento del RNA viral . De acuerdo a Novina et al.2  cuando células transfectadas con anti-gag siARN son expuestas al VIH, decrece la producción in vitro de p24. Algo a destacar es el hecho que el anti-gag siARN también inhibe la producción de p24 en células que tienen provirus de VIH integrado en su genoma.

Los estudios del ARNi revelaron nuevos blancos posibles para controlar la infección del VIH. El ARN genómico del VIH resulta vulnerable muy poco después que el core entra al citoplasma y, el ARN mensajero viral  codificado ya por genes "tempranos" o "tardíos",  también puede ser degradadado.

Por otra parte el ARN mensajero celular que codifica proteínas claves para la entrada del VIH  es también potencialmente un punto de ataque. El ataque simultaneo con siARN a funciones virales y celulares estratégicas serían sinergicas. Simultaneamente el siARN podría actuar sinergicamente con las actuales drogas anti VIH, dado que los blancos moleculares son distintos. Sin embargo antes que el siARN pueda ser usado clinicame es necesario resolver una serie de importantes problemas.
bulletPrimero, un cambio aún de 1 pb disminuye dramáticamente el potencial del siARN 3,13 y, dado el alto grado de "errores" de la transcriptasa inversa del VIH  (1 cada 1000 nucleótidos por ciclo de replicación), rápidamente emergerían mutantes que escapan al siAR. Por otra part, la enorme diversidad de secuencias del VIH dentro y entre las personas infectadas dificulta el problema de diseñar siARN altamente específicos.
Otro enfoque sería apuntar a receptor o correceptor  celular esencial para la entrada del VIH, en efecto, luego de la transfección de células T en cultivo con siARN contra el ARN mensajero para el CD4, el principal receptor para el VIH, disminuyó la expresión 14,15  de CD4 en la superficie de la mayoría de las células, y la producción de VIH, luego de exponer dichas células al virus disminuyó sustancialmente.2.
El CCR5 es un blanco lógico para la terapia con siARN (Figura 2), dado que mutaciones homocigotas el el gen para dicho receptor no tiene efectos deletereos sobre la función inmunológica pero confiere un alto grado de inmunidad contra el VIH16,17
bulletSegundo, la introducción de siARN a las células no es un proceso eficiente. La transfección hidrodinámica 18,19,20  los introduce eficientemente en órganos blanco de ratas,21,22 pero este enfoque no es apto para un tratamientos clínico.
bulletEn tercer lugar se encuentra la crítica cuestión de la estabilidad del siARN. Para impedir la degradación del siARN por las ARNasas celulares se han utilizados, con éxito, plásmidos a ADN y vectores virales  que codifican para el siARN23 . La transfección de células humanas con plásmidos que codifica  anti-rev siARN4 (El gen  Rev  del VIH es indispensable para la exportación de ARN viral desde el núcleo) disminuye drasticamente la replicación del VIH por varios días.

El siARN tiene implicancias que va mas allá del VIH y el SIDA. El siARN puede degradar ARN producido por otros virus, como el virus de la poliomielitis o el del sincitial respiratorio24 25. Potencialmente el ARN mensajero de los oncogenes  de  células cancerosas pueden ser el blanco del siARN mientras que el expresado por el alelo normal puede sobrevivir.

Un aspecto mas excitante de la tecnología del siARN es su uso en el genoma funcional, donde se lo puede usar para "disecar" vías de señales (signaling pathways), identificar genes importantes para el desarrollo embrionario y dilucidar la función de nuevos genes en otros procesos biológicos fundamentales.

Si bién el siARN ha sido descubierto recientemente, el campo se ha expandido de manera explosiva. Resulta claro que el si ARN es un mecanismo molecular altamente conservado en células eucariotas para controlar la expresión de los genes durante el desarrollo embrionario y para defender sus genomas de invasores como los trasposones y virus a ARN.5  El siARN tiene el potencial para revolucionar la Biología.

Referencias

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