HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE LA BIOLOGÍA
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IV. - Un Gen,  dos Proteínas


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  • IV.1.- El Descubrimiento de la Proteína PrP

    Los estudios de las ESET condujeron al descubrimiento de una proteína proteasa-resistente de 27-30 kD procedente del agente infeccioso. Se la denominó PrP (Prion Protein). Poco después se demostró que la proteína PrP está codificada por un gen cromosómico de la célula hospedadora, y no por un hipotético ácido nucleico de la partícula infecciosa, como se esperaba. Para mayor desconcierto se descubrió que el gen PRP es expresado en organismos sanos.

    A mediados de los años 1980 fue identificado del producto del gen PRP, una proteína celular proteasea-sensible de 33-35 kD. Por lo tanto, es posible distinguir entre dos formas de la proteína PrP, una presente en organismos sanos y otra presente en organismos afectados. Estas formas proteasa-sensible y proteasa-resistente de la proteína PrP se denominaron PrPsen (o PrPc celular) y PrPres (o PrPsc scrapie), respectivamente.

    La concentración de la forma patogénica PrPsc en las células se incrementa progresivamente con la evolución de la enfermedad, llegando a acumularse en forma de placas amiloides extracelulares.

    El desarrollo de la enfermedad viene acompañado por una pérdida neuronal, cuya patogénesis y bases moleculares aún se desconocen. En ratones, concentraciones excesivas de PrPc pueden acarrear neurodegeneración y destrucción de músculos y nervios periféricos. Según los estudios de G. Forloni [17] la muerte celular se produce por apoptosis. La secuencia peptídica 106-126 de la proteína PrP posee una gran habilidad intrínseca para polimerizar in vitro en fibrillas y/o placas tipo amiloide (las células apoptóticas poseen una morfología distintiva y muestran un patrón característico de fragmentación del DNA, resultante de la rotura de DNA nuclear en regiones internucleosomales).

      http://www.cjd.ed.ac.uk/prpplaq.gif

IV.2.- Las formas PrPc y PrPsc

 

    En los últimos años varios fragmentos de la proteína PrP han sido incluidos en el PDB (Protein Data Bank). Por ejemplo:

    • 1ag2: NMR structure of mouse prion protein fragment 121-231.
    • 1b10: NMR structure of recombinant syrian hamster prion protein fragment 90-231.
    • 1dwy, 1dwz: NMR structure of bovine prion protein fragment 121-230.
    • 1dx0, 1dx1: NMR structure of bovine prion protein residues 23-330.
    • 1e1g, 1e1j: NMR structure of human prion protein variant m166v fragment 125-228.
    • 1e1p, 1e1s: NMR structure of human prion protein variant s170n fragment 125-228.
    • 1fkc, 1fo7: NMR structure of human prion protein mutant e200k fragment 90-231.
    • 1qlx: NMR structure of human prion protein fragment 23-230.

    La Proteína PrP Celular

    La forma PrPc es una proteína proteasa-sensible constituida por una sola cadena peptídica. Los datos espectroscópicos y las simulaciones por ordenador de F.E. Cohen indican que la forma PrPc presenta un empaquetamiento compacto con 4 hélices alfa (H1 a H4) y oligosacáridos complejos unidos a la proteína. PrPc posee una estructura en hélices alfa (42% hélices alfa, 3% láminas beta).

    PrP consta de 254 aminoácidos en ratones y hamsters y de 253 en el hombre. La proteína PrP está muy conservada en diversas especies, incluyendo humanos, ovejas, ratones, hamsters, Drosophila y bóvidos. Los residuos 113 hasta 128 son los más conservados.

    En su forma normal no infecciosa, PrP es una glicoproteína hidrofóbica soluble en presencia de cantidades significativas de solutos solubles no polares.

      PrPc se presenta como una proteína anclada a la superficie de las neuronas por medio de una molécula de GPI, y constituye un producto ampliamente expresado en las células. Los mRNA para PrP se han descubierto en diversos órganos, como bazo, músculo esquelético o pulmones. Pero, generalmente con índices de 10 a 50 veces inferiores que en el cerebro.
      En el SNC, PrP es esencialmente neuronal, situándose sobretodo en los botones sinápticos. Aún se desconoce la función que desempeña la PrP normal en las neuronas, pero su distribución hace sospechar que podría estar implicada en el proceso sináptico.
      Fuera del SNC, PrP se encuentra en los epitelios secretores, lo cual podría tener incidencia en la transmisión por vía oral.

    Según el trabajo de Borchelt et al., publicado en J.Biol.Chem [5] en 1992, PrPc es sintetizada en el RER, modificada en el aparato de Golgi y transportada a la superficie celular. Un péptido señal es escindido del extremo N-terminal durante la biosíntesis de PrP (en el RER) en ratones y hamsters. En hamsters, 23 aminoácidos son cortados del extremo C-terminal para la adicción de la molécula de GPI. Dos oligosacáridos se unen a nivel de residuos Asp situados en un lazo formado por la presencia de un puente disulfuro.

    En 1993, en un trabajo publicado en J. Biol Chem [41], Shyng et al. desvelan que chPrP, la homóloga en el pollo de la PrPc de los mamíferos, constituye ciclos entre la superficie celular y un compartimento endocítico, con un periodo de transición de aproximadamente 60 minutos. Alrededor del 95% de la proteína endocitada es retornada intacta a la superficie. Un pequeño porcentaje de las moléculas endocitadas sufren una rotura proteolítica tras la cual los fragmentos N y C-terminales son entonces expulsados.

    La Proteína PrP Patogénica

    A diferencia de la forma PrPc, la forma PrPsc presenta gran proporción de láminas beta (43% láminas beta, 30% hélices alfa).

    Propiedades que caracterizan a la forma patogénica de PrP:
    • Resistencia parcial a las proteasas.
    • En ocasiones se degrada y los fragmentos se agregan formando placas amiloides extracelulares.
    • Purificada por centrifugación, al microscopio electrónico, presenta aspecto de fibrillas o bastoncillos. Estas agregaciones se denominan SAF (Scrapie Associated Fibrils or Prion Rods) y corresponden a polímeros de PrPsc.

    La identificación de PrP en fracciones del agente infeccioso de scrapie, se produjo junto con el hallazgo de las SAF, cuya formación requiere una proteolisis parcial de PrP en presencia de detergentes.
    http://ss.niah.affrc.go.jp/bse/images/img0035.gif

IV.3.- Conversión de PrPc en PrPsc


    Ambas formas, PrPc y PrPsc, son codificadas por el gen PRP, pero no pueden ser el resultado de un procesamiento alternativo del mRNA, ya que en la mayoria de las especies estudiadas la secuencia codificadora para PrP (ORF) se halla contenida en un único exón. Diversos estudios han puesto de manifiesto que PrPsc es un derivado post-traduccional de PrPc. Esta hipótesis concuerda con el hecho de PrPsc se acumula lentamente en los cerebros de los animales infectados, a pesar de que los niveles de mRNA permanecen invariables durante la evolución de la enfermedad (B. Oesch et al.[29] y K. Basler et al.[2]).

    El origen de la proteína PrPsc aún sigue constituyendo un misterio.

    Ya que los agentes infecciosos parecen estar compuestos en su totalidad o en gran parte por PrPsc, es importante determinar cómo y dónde tiene lugar la síntesis de PrPsc. O bien, equivalentemente, cómo y dónde adquiere PrPc o el precursor de PrPsc la resistencia a proteasas. Actualmente se investiga la posibilidad de tratar las ESET mediante farmacos que inhiban la conversión de PrPc en PrPsc.

    Ambas formas de PrP se han detectado en el aparato de Golgi, donde son modificados sus oligosacáridos y se adicciona ácido siálico. PrPc es transportada mediante vesículas secretoras hasta la membrana externa de la célula, donde la proteína queda anclada mediante una molécula de GPI. Para obtener evidencias definitivas acerca de si PrPsc se forma o no a partir de un precursor (similar a PrPc) de la superficie celular, B. Caughey y G.J. Raymond (1991) [11], analizaron el efecto del tratamiento con PIPLC y tripsina. Previamente, en 1990, habían demostrado que PIPLC elimina la mayoría de las moléculas de PrPsen de la superficie celular, mientras que no afecta a PrPres. Luego, si PrPres se forma a partir de un precursor de la superficie celular PIPLC-sensible, como PrPsen, la eliminación de dicho precursor reduciría el número de precursores que llegan a madurar y por lo tanto, los niveles posteriores de PrPres. Los resultados cumplieron las expectativas: La cuantificación de los efectos del tratamiento con PIPLC mostró que el nivel de PrPres posterior es un 97% inferior en las células tratadas frente a las células control, mientras que el nivel total de PrP sólo es reducido en un 6%.

    Diversos estudios han aportado evidencias de que PrPres se acumula en compartimentos intracelulares. Puesto que los resultados de Caughey y Raymond demuestran que el precursor de PrPres se localiza en la superficie celular, se deduce que debe producirse una entrada continua de PrPres o de su precursor mediante endosomas, y no una formación directa de PrPres durante la biosíntesis de PrPc en el aparato de Golgi.

    B.W. Caughey y P.T. Lansbury comprobaron que PrPc puede ser convertida en PrPsc en un tubo de ensayo, al mezclar ambas formas de PrP. Estudios recientes con ratones transgénicos han indicado que PrPc, en presencia de PrPsc inoculada, es convertida más eficazmente en PrPsc si las secuencias de ambas proteínas son idénticas o similares.

    Para justificar la conversión de PrPc en PrPsc se han propuesto diversas hipótesis:

    • Según la teoría pura del prion de Prusiner, habría una interacción directa entre una molécula de PrPc y una de PrPsc [32]. PrPsc induciría la conversión de PrPc en una segunda molécula de PrPsc, copia idéntica de la primera. Los heterodímeros actuarían como intermediarios de replicación en la síntesis de PrPsc.
      Sin embargo, aún no se han detectado agregados de PrPc-PrPsc.
    • También se ha propuesto que la modificación estructural podría ser el resultado de un proceso de polimerización en cadena, iniciado por la PrPsc inoculada que actuaría como cristal iniciador. El modelo de semilla o núcleo consta generalmente de 6 unidades de PrP [23].
    • Aún se baraja la posibilidad de una modificación química post-traduccional.
    • También se contempla la posibilidad de la existencia de otros elementos ajenos a la proteína PrP que, en presencia de PrPsc, interferirían con PrPc induciendo su cambio conformacional.
    • En la teoría del holoprion de Weissmann [49], la conversión de PrPc en la forma patogénica PrPsc puede ser mediada por un holoprion o por la unión de un coprion a PrPc. La modificación implicaría alteraciones químicas o conformacionales.
      (Ampliado en el Capítulo II).
    • Otros investigadores apoyan la intervención de chaperonas, las cuales modificarían el plegamiento de PrPc o de su precursor. PrPsc incluso podría ser la chaperona de PrP.
      La idea surgió a partir de la observación de que los factores de levadura [URE] y [psi+] se asemejan mucho a los priones de los mamíferos. El primer factor [psi+] fue hallado en ciertas cepas de laboratorio de Saccharomices cerevisiae. Sin embargo, no se hallaron elementos extracromosómicos de RNA ni de DNA que codificarán para [psi+]. El incremento de la concentración de Gdn-HCl es el tratamiento más eficaz conocido para inactivar [psi+]. En un principio, el efecto de Gdn-HCl se atribuyó a una actividad desnaturalizante sobre [psi+]. Sin embargo, la concentración de 5mM comúnmente empleada es demasiado baja para causar una desnaturalización significativa. Chernoff et al [13] sugirieron en 1995 que, en realidad, el efecto de Gdn-HCl sobre [psi+] es consecuencia indirecta de su acción sobre las proteínas chaperonas Hsp104.
      A partir de los resultados, concluyen que las chaperonas también podrían desempeñar un papel importante en le propagación de la PrPsc de los mamíferos, y que determinados niveles de expresión de las chaperonas podrían curar las células infectadas de priones, sin dañar su viabilidad.

IV.4.- El Gen PRP


En humanos, el gen que codifica para PrP se ha sido localizado en el brazo corto del cromosoma 20. Schnittger determinó que dentro de la región 20p12-pter, el locus es pter-PRP-SCG1. El gen completo ha sido secuenciado y se ha visto que está constituido por 2 exones y un intrón. El extremo 5' del sitio de inicio de la transcripción presenta alta repetición de pares GC. Según un estudio reciente, ya se conocen 13 alelos para el gen PRP humano.

En ovejas se conocen 8 alelos para PRP. Cada alelo es el resultado de una mutación puntual y su frecuencia varia según raza y rebaño. El alelo PrPMARH se ha asociado con altas incidencias de scrapie. La secuenciación del gen en ovejas ha puesto de manifiesto la existencia de regiones homólogas en los genes ovino y humano.

En bóvidos, los alelos se diferencian en el número de elementos GC.

Los 2 exones del gen PRP de hamster están separados por un intrón de 10 kb. El exón 1 codifica una porción de la secuencia lider 5', mientras que el exón 2 codifica la proteína PrP y la secuencia no traducida 3'.

El gen PRP de ratón está compuesto por 3 exones, con un exón 3 análogo al exón 2 de hamster. La localización de los genes PRP en el brazo corto del cromosoma 20 humano y en una región homóloga del cromosoma 2 del ratón, hizo que R.S. Sparkes et al. y N.K. Robakis et al. sugirieran, en 1986, que los genes PRP existían antes de la especiación de los mamíferos.

En el hombre se han hallado mutaciones en la región codificadora del gen PRP, en todas las formas familiares de las ESET: GSS, CJD y FFI. Las mutaciones son resultado de sustituciones no conservativas. Por el contrario, no se han hallado mutaciones en el gen PRP en las formas esporádicas de las ESET. Los casos de CJD familiar sugieren que los factores genéticos podrían influir en la patogénesis. Estudios transgénicos, han confirmado que mutaciones del gen PRP pueden causar neurodegeneración. La mutación Pro-Leu (P102L) fue la primera que se pudo relacionar con la disfunción del SNC: La mutación P102L de GSS se introdujo en genes PRP de ratón (moPRP). Cinco líneas de ratones transgénicos, con amplia expresión del gen PRP mutado, desarrollaron degeneración del SNC consistente en vacuolización de los citoplasmas neuronales, gliosis astrocítica y formación de placas amiloides de PrP.

Por otra parte, experimentos con ratones transgénicos portadores de varias copias del gen PRP, permitieron demostrar que el número de copias del gen está relacionado con la susceptibilidad a las ESET, la duración del periodo de incubación y la barrera de especie. Así, la duración del periodo de incubación es inversamente proporcional a número de copias del gen PRP.

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