IV. - Un Gen, dos Proteínas
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IV.1.- El Descubrimiento de la Proteína PrPLos estudios de las ESET condujeron al descubrimiento de una
proteína proteasa-resistente de 27-30 kD procedente del agente
infeccioso. Se la denominó PrP (Prion Protein). Poco después se
demostró que la proteína PrP está codificada por un gen cromosómico de
la célula hospedadora, y no por un hipotético ácido nucleico de la
partícula infecciosa, como se esperaba. Para mayor desconcierto se
descubrió que el gen PRP es expresado en organismos sanos.
A mediados de los años 1980 fue identificado del producto del gen
PRP, una proteína celular proteasea-sensible de 33-35 kD. Por lo tanto,
es posible distinguir entre dos formas de la proteína PrP, una presente
en organismos sanos y otra presente en organismos afectados. Estas
formas proteasa-sensible y proteasa-resistente de la proteína PrP se
denominaron PrPsen (o PrPc celular) y PrPres (o PrPsc scrapie),
respectivamente.
La concentración de la forma patogénica PrPsc en las células se
incrementa progresivamente con la evolución de la enfermedad, llegando a
acumularse en forma de placas amiloides extracelulares.
El desarrollo de la enfermedad viene acompañado por una pérdida
neuronal, cuya patogénesis y bases moleculares aún se desconocen. En
ratones, concentraciones excesivas de PrPc pueden acarrear
neurodegeneración y destrucción de músculos y nervios periféricos. Según
los estudios de G. Forloni [17] la muerte celular se produce por
apoptosis. La secuencia peptídica 106-126 de la proteína PrP posee una
gran habilidad intrínseca para polimerizar in vitro en fibrillas
y/o placas tipo amiloide (las células apoptóticas poseen una morfología
distintiva y muestran un patrón característico de fragmentación del DNA,
resultante de la rotura de DNA nuclear en regiones internucleosomales).
http://www.cjd.ed.ac.uk/prpplaq.gif
IV.2.- Las formas PrPc y PrPsc
En los últimos años varios fragmentos de la proteína PrP han sido
incluidos en el PDB (Protein Data Bank). Por ejemplo:
- 1ag2:
NMR structure of mouse prion protein fragment 121-231.
- 1b10:
NMR structure of recombinant syrian hamster prion protein fragment
90-231.
- 1dwy,
1dwz:
NMR structure of bovine prion protein fragment 121-230.
- 1dx0,
1dx1:
NMR structure of bovine prion protein residues 23-330.
- 1e1g,
1e1j:
NMR structure of human prion protein variant m166v fragment
125-228.
- 1e1p,
1e1s:
NMR structure of human prion protein variant s170n fragment
125-228.
- 1fkc,
1fo7:
NMR structure of human prion protein mutant e200k fragment
90-231.
- 1qlx:
NMR structure of human prion protein fragment 23-230.
La Proteína PrP Celular
La forma PrPc es una proteína proteasa-sensible constituida por una
sola cadena peptídica. Los datos espectroscópicos y las simulaciones por
ordenador de F.E. Cohen indican que la forma PrPc presenta un
empaquetamiento compacto con 4 hélices alfa (H1 a H4) y oligosacáridos
complejos unidos a la proteína. PrPc posee una estructura en hélices
alfa (42% hélices alfa, 3% láminas beta).
PrP consta de 254 aminoácidos en ratones y hamsters y de 253 en el
hombre. La proteína PrP está muy conservada en diversas especies,
incluyendo humanos, ovejas, ratones, hamsters, Drosophila y bóvidos. Los
residuos 113 hasta 128 son los más conservados.
En su forma normal no infecciosa, PrP es una glicoproteína
hidrofóbica soluble en presencia de cantidades significativas de solutos
solubles no polares.
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PrPc se presenta como una proteína anclada a la superficie
de las neuronas por medio de una molécula de GPI, y constituye
un producto ampliamente expresado en las células. Los mRNA para
PrP se han descubierto en diversos órganos, como bazo, músculo
esquelético o pulmones. Pero, generalmente con índices de 10 a
50 veces inferiores que en el cerebro. En el SNC, PrP es
esencialmente neuronal, situándose sobretodo en los botones
sinápticos. Aún se desconoce la función que desempeña la PrP
normal en las neuronas, pero su distribución hace sospechar que
podría estar implicada en el proceso sináptico. Fuera del
SNC, PrP se encuentra en los epitelios secretores, lo cual
podría tener incidencia en la transmisión por vía oral.
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Según el trabajo de Borchelt et al., publicado en
J.Biol.Chem [5] en 1992, PrPc es sintetizada en el RER,
modificada en el aparato de Golgi y transportada a la superficie
celular. Un péptido señal es escindido del extremo N-terminal durante la
biosíntesis de PrP (en el RER) en ratones y hamsters. En hamsters, 23
aminoácidos son cortados del extremo C-terminal para la adicción de la
molécula de GPI. Dos oligosacáridos se unen a nivel de residuos Asp
situados en un lazo formado por la presencia de un puente disulfuro.
En 1993, en un trabajo publicado en J. Biol Chem [41],
Shyng et al. desvelan que chPrP, la homóloga en el pollo
de la PrPc de los mamíferos, constituye ciclos entre la superficie
celular y un compartimento endocítico, con un periodo de transición de
aproximadamente 60 minutos. Alrededor del 95% de la proteína endocitada
es retornada intacta a la superficie. Un pequeño porcentaje de las
moléculas endocitadas sufren una rotura proteolítica tras la cual los
fragmentos N y C-terminales son entonces expulsados.
La Proteína PrP Patogénica
A diferencia de la forma PrPc, la forma PrPsc presenta gran
proporción de láminas beta (43% láminas beta, 30% hélices alfa).
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Propiedades que caracterizan a la forma patogénica de PrP:
- Resistencia parcial a las proteasas.
- En ocasiones se degrada y los fragmentos se agregan
formando placas amiloides extracelulares.
- Purificada por centrifugación, al microscopio electrónico,
presenta aspecto de fibrillas o bastoncillos. Estas
agregaciones se denominan SAF (Scrapie Associated Fibrils
or Prion Rods) y corresponden a polímeros de PrPsc.
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La identificación de PrP en fracciones del agente infeccioso
de scrapie,
se produjo junto con el hallazgo de las SAF, cuya formación
requiere una proteolisis parcial de PrP en presencia de
detergentes. |
http://ss.niah.affrc.go.jp/bse/images/img0035.gif |
IV.3.- Conversión de PrPc en PrPsc
Ambas formas, PrPc y PrPsc, son codificadas por el gen PRP, pero no
pueden ser el resultado de un procesamiento alternativo del mRNA, ya que
en la mayoria de las especies estudiadas la secuencia codificadora para
PrP (ORF) se halla contenida en un único exón. Diversos estudios han
puesto de manifiesto que PrPsc es un derivado post-traduccional de PrPc.
Esta hipótesis concuerda con el hecho de PrPsc se acumula lentamente en
los cerebros de los animales infectados, a pesar de que los niveles de
mRNA permanecen invariables durante la evolución de la enfermedad (B.
Oesch et al.[29] y K. Basler et al.[2]).
El origen de la proteína PrPsc aún sigue constituyendo un misterio.
Ya que los agentes infecciosos parecen estar compuestos en su
totalidad o en gran parte por PrPsc, es importante determinar cómo y
dónde tiene lugar la síntesis de PrPsc. O bien, equivalentemente, cómo y
dónde adquiere PrPc o el precursor de PrPsc la resistencia a proteasas.
Actualmente se investiga la posibilidad de tratar las ESET mediante
farmacos que inhiban la conversión de PrPc en PrPsc.
Ambas formas de PrP se han detectado en el aparato de Golgi, donde
son modificados sus oligosacáridos y se adicciona ácido siálico. PrPc es
transportada mediante vesículas secretoras hasta la membrana externa de
la célula, donde la proteína queda anclada mediante una molécula de GPI.
Para obtener evidencias definitivas acerca de si PrPsc se forma o no a
partir de un precursor (similar a PrPc) de la superficie celular, B.
Caughey y G.J. Raymond (1991) [11], analizaron el efecto del
tratamiento con PIPLC y tripsina. Previamente, en 1990, habían
demostrado que PIPLC elimina la mayoría de las moléculas de PrPsen de la
superficie celular, mientras que no afecta a PrPres. Luego, si PrPres se
forma a partir de un precursor de la superficie celular PIPLC-sensible,
como PrPsen, la eliminación de dicho precursor reduciría el número de
precursores que llegan a madurar y por lo tanto, los niveles posteriores
de PrPres. Los resultados cumplieron las expectativas: La cuantificación
de los efectos del tratamiento con PIPLC mostró que el nivel de PrPres
posterior es un 97% inferior en las células tratadas frente a las
células control, mientras que el nivel total de PrP sólo es reducido en
un 6%.
Diversos estudios han aportado evidencias de que PrPres se acumula en
compartimentos intracelulares. Puesto que los resultados de
Caughey y Raymond demuestran que el precursor de PrPres se
localiza en la superficie celular, se deduce que debe producirse una
entrada continua de PrPres o de su precursor mediante endosomas, y no
una formación directa de PrPres durante la biosíntesis de PrPc en el
aparato de Golgi.
B.W. Caughey y P.T. Lansbury comprobaron que PrPc puede
ser convertida en PrPsc en un tubo de ensayo, al mezclar ambas formas de
PrP. Estudios recientes con ratones transgénicos han indicado que PrPc,
en presencia de PrPsc inoculada, es convertida más eficazmente en PrPsc
si las secuencias de ambas proteínas son idénticas o similares.
Para justificar la conversión de PrPc en PrPsc se han propuesto
diversas hipótesis:
- Según la teoría pura del prion de Prusiner, habría una
interacción directa entre una molécula de PrPc y una de PrPsc [32].
PrPsc induciría la conversión de PrPc en una segunda molécula de
PrPsc, copia idéntica de la primera. Los heterodímeros actuarían como
intermediarios de replicación en la síntesis de PrPsc.
Sin
embargo, aún no se han detectado agregados de PrPc-PrPsc.
- También se ha propuesto que la modificación estructural podría ser
el resultado de un proceso de polimerización en cadena, iniciado por
la PrPsc inoculada que actuaría como cristal iniciador. El modelo de
semilla o núcleo consta generalmente de 6 unidades de PrP [23].
- Aún se baraja la posibilidad de una modificación química
post-traduccional.
- También se contempla la posibilidad de la existencia de otros
elementos ajenos a la proteína PrP que, en presencia de PrPsc,
interferirían con PrPc induciendo su cambio conformacional.
- En la teoría del holoprion de Weissmann [49], la conversión
de PrPc en la forma patogénica PrPsc puede ser mediada por un
holoprion o por la unión de un coprion a PrPc. La modificación
implicaría alteraciones químicas o conformacionales.
(Ampliado
en el Capítulo II).
- Otros investigadores apoyan la intervención de chaperonas, las
cuales modificarían el plegamiento de PrPc o de su precursor. PrPsc
incluso podría ser la chaperona de PrP.
La idea surgió a partir de
la observación de que los factores de levadura [URE] y [psi+] se
asemejan mucho a los priones de los mamíferos. El primer factor [psi+]
fue hallado en ciertas cepas de laboratorio de Saccharomices
cerevisiae. Sin embargo, no se hallaron elementos
extracromosómicos de RNA ni de DNA que codificarán para [psi+]. El
incremento de la concentración de Gdn-HCl es el tratamiento más eficaz
conocido para inactivar [psi+]. En un principio, el efecto de Gdn-HCl
se atribuyó a una actividad desnaturalizante sobre [psi+]. Sin
embargo, la concentración de 5mM comúnmente empleada es demasiado baja
para causar una desnaturalización significativa. Chernoff et
al [13] sugirieron en 1995 que, en realidad, el efecto de
Gdn-HCl sobre [psi+] es consecuencia indirecta de su acción sobre las
proteínas chaperonas Hsp104. A partir de los resultados, concluyen
que las chaperonas también podrían desempeñar un papel importante en
le propagación de la PrPsc de los mamíferos, y que determinados
niveles de expresión de las chaperonas podrían curar las células
infectadas de priones, sin dañar su viabilidad.
IV.4.- El Gen PRP
En humanos, el gen que codifica para PrP se ha sido
localizado en el brazo corto del cromosoma 20. Schnittger
determinó que dentro de la región 20p12-pter, el locus es pter-PRP-SCG1.
El gen completo ha sido secuenciado y se ha visto que está constituido
por 2 exones y un intrón. El extremo 5' del sitio de inicio de la
transcripción presenta alta repetición de pares GC. Según un estudio
reciente, ya se conocen 13 alelos para el gen PRP humano.
En ovejas se conocen 8 alelos para PRP. Cada alelo es el
resultado de una mutación puntual y su frecuencia varia según raza y
rebaño. El alelo PrPMARH se ha asociado con altas incidencias de
scrapie. La secuenciación del gen en ovejas ha puesto de manifiesto la
existencia de regiones homólogas en los genes ovino y humano.
En bóvidos, los alelos se diferencian en el número de
elementos GC.
Los 2 exones del gen PRP de hamster están separados por un
intrón de 10 kb. El exón 1 codifica una porción de la secuencia lider
5', mientras que el exón 2 codifica la proteína PrP y la secuencia no
traducida 3'.
El gen PRP de ratón está compuesto por 3 exones, con un exón 3
análogo al exón 2 de hamster. La localización de los genes PRP en el
brazo corto del cromosoma 20 humano y en una región homóloga del
cromosoma 2 del ratón, hizo que R.S. Sparkes et al. y
N.K. Robakis et al. sugirieran, en 1986, que los genes PRP
existían antes de la especiación de los mamíferos.
En el hombre se han hallado mutaciones en la región codificadora del
gen PRP, en todas las formas familiares de las ESET: GSS, CJD y
FFI.
Las mutaciones son resultado de sustituciones no conservativas. Por el
contrario, no se han hallado mutaciones en el gen PRP en las formas
esporádicas de las ESET. Los casos de CJD familiar sugieren que los
factores genéticos podrían influir en la patogénesis. Estudios
transgénicos, han confirmado que mutaciones del gen PRP pueden causar
neurodegeneración. La mutación Pro-Leu (P102L) fue la primera que se
pudo relacionar con la disfunción del SNC: La mutación P102L de GSS se
introdujo en genes PRP de ratón (moPRP). Cinco líneas de ratones
transgénicos, con amplia expresión del gen PRP mutado, desarrollaron
degeneración del SNC consistente en vacuolización de los citoplasmas
neuronales, gliosis astrocítica y formación de placas amiloides de PrP.
Por otra parte, experimentos con ratones transgénicos portadores de
varias copias del gen PRP, permitieron demostrar que el número de copias
del gen está relacionado con la susceptibilidad a las ESET, la duración
del periodo de incubación y la barrera de especie. Así, la duración del
periodo de incubación es inversamente proporcional a número de copias
del gen PRP.
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