TRABAJO PRÁCTICO

Los géneros que se encuentra con relativa frecuencia en la naturaleza, por ejemplo sobre los frutos en putrefacción, semillas, forrajes, cueros, maderas, etc. También se lo encuentra normalmente en el suelo. Para aislarlo se tiene en cuenta su estado natural, procediendo luego de acuerdo con las técnicas siguientes:

Para la identificación de un moho se precisa una descripción completa del organismo. Para estudiar sus características, se prefiere el medio de Czapeck que es un medio satisfactorio y da muy buenos resultados con fines comparativos.

El examen de los cultivos debe hacerse diariamente, por lo menos durante la primera y segunda semana de incubación. Las observaciones macroscópicas deben realizarce con la ayuda de una lupa. En general es posible determinar, por el examen visual, si una colonia de hongos es filamentosa o levaduriforme. Las colonias de hongos filamentosos tienen un aspecto velloso o acordonado, mientras que las levaduras producen colonias mantecosas con superficies lisas.

Las colonias individuales desarrolladas en el medio Czapeck, se pueden estudiar a simple vista, con la lupa y al microscopio con poco aumento. Podemos así deducir lo siguiente: velocidad y forma de crecimiento, tamaño y color de los cuerpos fructíferos e hifas; elevación y densidad de las distintas partes de la colonia, presencia o ausencia de peritecios, variaciones en la forma y tamaño de los núcleos de mohos. Debe observarse la consistencia de la superficie de la colonia, el plegamiento, la nitidez del borde y la presencia de pigmentos en la superficie o el reverso o su difusión hacia el medio circundante

Invirtiendo la placa de Petri puede observarse el color del fondo de la colonia, así como cualquier coloración producida en el medio.

Estas observaciones son suficientes para indicar la clase u orden a que pertenece el hongo, pero para identificar el género y la especie es preciso el estudio al microscopio.

Con las esporas se efectúan las observaciones siguientes: forma, tamaño, color, características y colocación. En las hifas fértiles se examinan: ramas, tabiques, anchura, color, características y naturaleza de las paredes (lisas, picadas o rugosas).

A partir de las observaciones así adquiridas y complementadas con las técnicas de coloraciones conocidas, puede intentarse la identificación del moho conociendo la descripción de los géneros.

Existe una gran cantidad de medios de cultivos para la propagación y estudio de hongos, pero la mayoría han sido diseñados con alguna finalidad especial, tales como la seguridad de un crecimiento óptimo o para determinar la necesidad de una sustancia específica para un moho determinado.

Los medios para Micología difieren en varios aspectos de aquellos que se usan en Bacteriología. Estos últimos por lo general son levemente alcalino, mientras que la mayoría de los hongos prefieren un medio ácido e incluso muchas especies toleran una acidez relativamente alta. Los medios de bacteriología normalmente contienen proteínas como fuente tanto de carbono como de nitrógeno. En cambio para hongos, se usa hidratos de carbono como fuente de energía, y el nitrógeno se suministra como sales inorgánicas, sea como nitrato o como sales de amonio.

Los elementos químicos esenciales para el cultivo de hongos son: C, H, O, S, N, P, K, Mg, Fe, etc. También son necesarias cantidades mínimas de otros elementos para el crecimiento de ciertos hongos. La mayoría de los medios naturales y de los medios sintéticos preparados con drogas de calidad técnica, normalmente contienen suficiente cantidad de los llamados "elementos trazas", pero a veces es necesario agregarlos deliberadamente cuando se preparan con drogas de calidad analítica.

Muchos vegetales y extractos vegetales son especialmente adecuados como medios de cultivos sin ningún agregado, o sólo con el agregado de azúcar y en algunos casos son útiles para el aislamiento y conservación de mohos. En algunos tipos de trabajo, tales como estudios nutricionales o investigaciones bioquímicas, se usa casi exclusivamente medios sintéticos, ya que es necesario conocer la composición, para poder repetir la fórmula en caso necesario.

El tipo de crecimiento para una especie determinada varía según el medio de cultivo utilizado y en consecuencia, es de gran importancia cuando se describe una especie, registrar las observaciones hechas sobre medios preparados en forma idéntica a la de otros autores.

Los medios de cultivos pueden ser sólidos o líquidos. El medio sólido puede ser en dos sentidos, ya sea aquellos medios sólidos, normalmente porciones de raíces, tallos o semillas o bien medios solidificados con el agregado de gelatina o agar.

Principalmente para levaduras y mucorales. Se compone de:

Modo operativo:

Colocar todos los componentes en un erlenmeyer de 2 litros, dejar reposar unos 10 minutos para que el agar se embeba en agua, llevar a pH 6,5 con ácido sulfúrico, colocar primero el erlenmeyer en baño maría o en el microonda hasta que se consiga fundir el agar, fraccionar en tubos, esterilizar en autoclave 20 minutos a 1 atm., inclinar los tubos y dejar solidificar en pico de flauta, conservarlos en heladera hasta su uso, aunque es más recomendable tenerlos en el laboratorio a temperatura ambiente ya que en la heladera el medio de cultivo se deseca más rápidamente. A veces es conveniente, filtrar por algodón antes de fraccionar.

Medio de Sabouraud-miel líquido

Se prepara igual al anterior, con la diferencia que no se agrega agar ni se inclinan los tubos al final.

Medio de Czapek Se compone de:

Modo operativo:

Disolver las sales y la sacarosa en el agua, agregar el agar y dejar reposar unos 10 minutos para que el agar se embeba, llevar al microonda para fundir el agar, continuar el proceso igual para preparar el medio de Sabouraud-miel sólido, (al igual que en dicho medio, hay que ajustar el pH a 6,5) . Algunos autores recomiendan agregar la sacarosa después que se hayan disuelto los demás componentes y fundido el agar, en el momento previo a la filtración, agitando bien.

Cortar trozos de zanahorias en forma de cuña, de un largo de unos 6 a 8 cm. (con un sacabocados se sacan los cilindros y luego con un cuchillo se les da la forma de cuña), se sumergen los trozos en una solución acuosa de ácido láctico al 3% hasta que estén bien embebidos. Luego se los coloca en tubos de Roux, un trozo en cada tubo, la zanahoria descansa en la estrangulación, y en la ampolla inferior se coloca la solución de ácido láctico haciendo que cubra la parte inferior de la zanahoria. Si no se dispone de tubos de Roux, se coloca el trozo de zanahoria en un tubo de ensayo común al que se le agrega la solución de ácido láctico hasta una cuarta parte de la altura del trozo para evitar su desecación, taponar con algodón y esterilizar 20 minutos a 1 atm. La siembre de la levadura se efectúa en la parte superior del trozo.

De la misma se puede preparar este medio con papa en lugar de zanahoria para ser utilizada por hongos filamentosos.

Agregar a 1 litro de agua corriente, 100 gr. de papa rallada y dejar macerar 30 minutos, hervir durante 30 minutos y filtrar por Buchner o por algodón, 1,5% de agar, disolver el agar en micoonda y agregar 2% de glcosa (dextrosa), repartir en tubos y esterilizar 20 minutos a 1 atm.

INCUBACIÓN

Generalmente se incuban a temperatura ambiente o a 30°C; algunos hongos pueden requerir temperaturas de 35-37°C, sobre todos en los dimórficos para demostrar su capacidad levaduriforme. Se puede utilizar un recipiente con agua en la estufa, para mantener una elevada humedad ambiente.

Preparados para el estudio microscópico de los hongos

Pueden usarse diversos métodos para el examen microscópico de hongos

MÉTODO DE MONTAJE CON HOK

El hidroxido de potasio se utiliza para muestras como piel, raspado de uñas y pelos infectados o muestras de esputos.

Se coloca una gota de HOK al 10% que contiene glicerina en un portaobjeto y se mezcla con una pequeña cantidad de material a examinar (piel, pelo, escamas, etc..). Se pasa suavemente el portaobjeto a través de la llama baja de un mechero Bunsen para facilitar el aclaramiento (no hervir). Se coloca un cubreobjeto sobre la gota y se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 minutos. Se examina en el micróscopio buscando las hifas micóticas.

MÉTODO DE MONTAJE HÚMEDO

El procedimiento se lleva a cabo con el ansa de gancho o con una aguja montada sobre un trozo de varilla, se procede tomando una pequeña porción de la colonia a estudiar (a veces es necesario ayudarse con otra ansa). La muestra debe tomarse de un sitio intermedio entre el centro y la periferia de la colonia. Este pequeño fragmento de colonia se transfiere a una gota de lactofenol azul de algodón en un portaobjeto y se cubre con un cubreobjeto. Se presiona suavemente directamente sobre el fragmento de la colonia para deprimir las hifas y otras estructuras y permitir un mejor examen microscópico.

MÉTODO DE MONTAJE CON CINTA ADHESIVA

Se aconseja usar cinta adhesiva de alta transparencia. Se hace un doblez de una tira de 4 cm, con el lado adhesivo hacia afuera , y se sostiene entre los dedos pulgar e índice. El lado adhesivo se presiona firmemente contra la superficie de la colonia del hongo. El micelio aéreo se adhiere a la superficie y puede separarse del resto.

Las tiras de cinta inoculadas se colocan en una gotita de lactofenol-azul de algodón en un portaobjeto.

MÉTODO DE MICROCULTIVO

El preparado de microcultivo (también conocido como cultivo en portaobjeto) se realiza de la siguiente manera:

Comúnmente hallados:

Encontrados rara vez:

Conidios multicelulares:

Tabiques transversales y longitudinales

Conidios unicelulares:

Aureabasidium (Pullularia)

Producción de Picnidios:

Phoma

Producción de Peritecios

Especies de crecimiento lento:

Conidióforos que terminan en una vesícula dilatada

Especies de Aspergillus

Conidióforos que se ramifican en un "penicilio"

Conidios en racimos:

Conidios transportados aisladamente

Dermatofitos:

Especies de Microsporum

M. audouinii

Especies de Trichophyton

Especies de Epidermophyton:

Mohos dimórficos:

Bacterias filamentosas ramificadas: