1. EFECTO DE LAS RADIACIONES SOBRE LAS BACTERIAS

1.1. CONCEPTOS GENERALES SOBRE LAS RADIACIONES Y LAS BIOMOLÉCULAS

1.2. CLASES DE EFECTOS DE LAS RADIACIONES

1.3. LAS RADIACIONES IONIZANTES Y SUS APLICACIONES

1.4. EFECTOS DE LOS RAYOS UV

1.4.1. FOTOPRODUCTOS DEL ADN

1.4.2 MECANISMOS DE REPARACIÓN DE LOS FOTOPRODUCTOS

1.4.3. APLICACIONES DE LOS RAYOS UV

1.5. EFECTOS DE LA LUZ VISIBLE

2. EFECTOS DE LAS ONDAS SONORAS

3. EFECTOS DE LA PRESIÓN HIDROSTÁTICA

3. EFECTOS DE LA PRESIÓN OSMÓTICA

4. EFECTOS DEL pH

BARRA DE EXPLORACIÓN: Microbiología General

Se puede definir la radiación como la propagación de energía por el espacio. Los principales tipos de radiaciones que pueden tener efectos sobre los seres vivos son:

La radiación particulada, con carga y masa consiste en:

• rayos a (núcleos de He)
• rayos ß (electrones)

Como se recordará, la radiación electromagnética presenta un doble aspecto: ondulatorio y cuántico (=paquetes discretos de energía, cuantos o quanta).

Cuando una molécula absorbe la energía de un cuanto de radiación electromagnética, se pueden producir una serie de cambios en los niveles energéticos de algunos de sus átomos.

La energía de un cuanto (E) está inversamente relacionada con su longitud de onda (l , en nm), según la ecuación de Planck:

E = h·c/l

siendo h= constante de Planck (6.62·10^-27 erg·seg^-1) y c= velocidad de la luz (2.99·10¹⁷ nm·seg^-1)

Teniendo en cuenta los valores de las constantes y la equivalencia 1 eV=1.59·10^-12 erg, la ecuación de Planck se puede expresar como:

E = 1240/l (en eV)

Sustituyendo l por sus valores concretos correspondientes a distintos tipos de radiaciones electromagnéticas, se calculan fácilmente los respectivos rangos de energía:

rayos X: 9000-91 eV

luz UV: 91-3.3 eV

visible: 3.3-1.5 eV

Las fuentes naturales nos llegan desde el espacio: radiaciones de la luz solar (visible + UV) y los rayos cósmicos. Sin embargo, la capa de ozono de la alta atmósfera sirve de pantalla, evitando que lleguen a la biosfera las longitudes de onda del ultravioleta de menos de 190 nm, que son las más energéticas.

Los UV generados artificialmente son apantallados por material de vidrio.

Los rayos cósmicos tampoco llegan a la superficie terrestre.

Las principales fuentes artificiales de radiaciones (aparte de las visibles) son:

• máquinas de rayos X;
• radioisótopos (como el Co-60);
• reactores nucleares;
• aceleradores de partículas.

El número de cuantos absorbidos por un sistema biológico es proporcional al producto de: duración de la radiació por la intensidad de la radiación y por el coeficiente de absorción del material.

Los efectos derivados de la absorción de esa radiación dependen de:

• la energía de la radiación absorbida;
• la naturaleza del material.

Hagamos un tratamiento del tema en función de que la radiación provoque o no ionizaciones en el material, lo cual depende de la energía de los cuantos:

1) Si la energía es E>10 eV, hablamos de radiaciones ionizantes: son los rayos X y los rayos g .

El fotón de gran energía incide sobre el átomo, provocando la expulsión de un electrón de gran energía (fotoelectrón), y quedando el átomo en forma ionizada (cargado positivamente). El electrón expulsado suele tener energía suficiente para originar una nueva ionización, de la cual surge otro electrón de alta energía, etc... produciéndose una cadena de ionizaciones, con transferencia linear de energía, hasta que ésta se disipa en el material: el último electrón de la cadena es captado por otro átomo o molécula, que queda cargado negativamente. El resultado final es que se forman pares de iones (uno positivo y otro negativo).

A su vez, esos iones originados tienden a experimentar reorganizaciones electrónicas ulteriores, que dan pie a cambios químicos en el sistema que se había sometido a la irradiación.

2) Si la energía es E<10 eV, no se producen ionizaciones: los electrones del átomo o molécula pasan transitoriamente (de 10^-8 a 10^-10 segundos) a un nivel energético superior (entonces se habla de que el átomo o molécula están excitados), pero enseguida dicho electrón vuelve al estado energético inicial.

En su regreso a su nivel energético previo, el electrón puede dar origen a una variedad de fenómenos:

• fluorescencia: emisión de energía a una longitud de onda mayor que la del fotón incidente;
• fotosensibilización: la energía se transfiere a otra molécula;
• reacciones fotoquímicas: se origina un cambio químico;
• emisión de calor: la energía simplemente se disipa en colisiones entre moléculas.

La luz visible y UV pueden dar origen a reacciones fotoquímicas, aparte de calor. Pero la radiación infrarroja sólo conduce a disipación de calor, si bien ciertas bacterias fotosintéticas anoxigénicas pueden aprovechar el infrarrojo para la fotosíntesis.

Los efectos de las radiaciones ionizantes dependen de la dosis de exposición, o sea, de la cantidad de radiación a que se somete un material. Se suele medir en unidades Roentgen (R):

1 R = energía de absorción de 83 erg·g^-1 de aire.

Por otro lado, la dosis de absorción es la fracción de la dosis de exposición que realmente se absorbe por el sistema biológico (es decir, es la dosis biológicamente efectiva). Se suele medir en rads:

1 rad = energía de absorción de 100 erg·g^-1 de aire.

En la práctica, la unidad que se emplea en Biología es el megarad (Mrad), equivalente a un millón de rads, y que es el rango de la dosis requerida para esterilizaciones. También se emplea el Gray (1Gy equivale a 100 rads).

En general, los microorganismos son más resistentes a las radiaciones ionizantes que los seres superiores. Por ejemplo, la dosis de reducción decimal (D10) para las endosporas de ciertas especies de Clostridium es de 2000-3000 Gy. Las células vegetativas de la bacteria Deinococcus radiodurans (observe el nombre específico) es de 2.200 Gy. Otras especies más "normales" poseen una dosis de reducción decimal en torno a 200-600 Gy. Compare estos datos con el valor de sólo 10 Gy como dosis letal para humanos.

Las fuentes de radiaciones ionizantes son los aparatos de rayos X, los rayos g y los radioisótopos, como el Co⁶⁰ o el Cs¹³⁷.

Los efectos de las radiaciones ionizantes son letales, tanto directos como indirectos, así como mutagénicos. Los efectos letales directos se logran a altas dosis de radiación, mientras que los letales indirectos y mutagénicos se consiguen a menores dosis.

1. Efecto letal directo: por impacto de cuantos de radiación ionizante sobre alguna molécula esencial para la vida. Los estudios cuantitativos demuestran que debe de existir una molécula vital única que, al ser alterada, provoca la muerte (teoría del golpe único). Esta molécula debe ser el ADN (ya que obviamente es absolutamente esencial y suministra una sola copia de la mayoría de los genes bacterianos), y no las proteínas, de las que existen muchas copias en la célula, y que podrían regenerarse. Los daños al ADN son, principalmente: roturas en ambas cadenas, y entrecruzamiento entre dichas cadenas, que no puedan repararse.
2. Efecto mutagénico: deriva de la producción de daños menores al ADN que pueden repararse por mecanismos propensos a error (véase apartado 1.4).
3. Efecto letal indirecto: este tipo de efecto es el más importante, y deriva de la radiolisis del agua que provoca la aparición de radicales hidroxilo (OH^-) e hidrógeno naciente (H·⁺). El hidrógeno naciente o radical H libre es un potente reductor, y el radical hidroxilo es un potente oxidante. El radical hidroxilo reacciona fácilmente con macromoléculas, sobre todo con ADN, provocando roturas en ambas cadenas, lo cual se traduce en efectos de letalidad. Si, además, la bacteria está expuesta al oxígeno mientras se la está irradiando, el efecto es aún más intenso, debido a que el O₂ reacciona con los radicales libres, originando cadenas de reacciones de autooxidación, muy destructivas, y promoviendo la formación de peróxidos y epóxidos, asimismo letales:

H^· + O₂ ------> ^·HO₂

2 ^·HO₂ ------> H₂O₂ + O₂

Las principales aplicaciones de las radiaciones ionizantes son la esterilización de:

• material farmacéutico;
• material médico-quirúrgico (guantes de cirujano, suturas de nylon, jeringas desechables, agujas, bisturíes, catéteres, prótesis, etc);
• alimentos envasados (aunque en algunos países aún sigue abierta la polémica po r parte de ciertos grupos sobre la seguridad de este tratamiento).

La dosis de esterilización por radiación se suele establecer en 12 veces la dosis de reducción decimal (12 D10) requerida frente a las endosporas de Clostridium botulinum. Debido al gran poder penetrante de las radiaciones hay que mantener unas normas y controles de seguridad muy estrictos en su manipulación: planchas protectoras de plomo y revisiones periódicas de los manipuladores.

La radiación UV tiene un efecto letal y mutagénico, que depende de su longitud de onda. Ello se debe a la absorción selectiva de longitudes de onda por parte de ciertas moléculas biológicas:

• Las proteínas tienen dos picos (es decir, máximos) de absorción: uno a 280 nm, debido a los aminoácidos aromáticos (Trp, Tyr, Phe), y otro a 230 nm, debido a los enlaces peptídicos.
• El ADN y el ARN absorben a 260 nm, debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases púricas y pirimidínicas.

Los rayos UV no tienen actividad ionizante, pero provocan cambios químicos en las moléculas absorbentes, de modo que aparecen moléculas alteradas denominadas genéricamente fotoproductos. Los fotoproductos originan la inactivación de macromoléculas, aunque, como veremos enseguida, el ADN dispone de mecanismos para paliar o eliminar estas modificaciones potencialmente lesivas.

Las consecuencias de inactivar proteínas o ARN no se dejan sentir a efectos de letalidad, ya que existen muchas copias de cada uno de estos tipos de macromoléculas, y se pueden volver a sintetizar.

En cambio, la inactivación del único cromosoma de la bacteria tiene efectos letales primarios y efectos mutagénicos secundarios. Por lo tanto, el espectro de acción biológica de la luz UV equivale al de absorción del UV por el ADN (260 nm).

Los fotoproductos generados por la luz UV en el ADN derivan principalmente de alteraciones en las bases pirimidínicas (citosina, timina):

1. dímeros de pirimidina (anillo ciclobutano)
2. fotoproducto de la endospora (5-timinil-5,6-dihidrotimina)
3. hidratos de pirimidina

Los dímeros de pirimidina son los fotoproductos más importantes en las células vegetativas bacterianas. El principal es el dímero de timina (T-T), aunque también se producen T-C y C-C. Se trata de aductos (uniones) entre dos pirimidinas adyacentes en la misma hebra de ADN, mediante la creación de un anillo de ciclobutano. Su efecto principal es la distorsión local de la configuración de la doble hélice, que interfiere en el normal emparejamiento de bases complementarias; ello, a su vez, provoca una interferencia en los procesos de replicación y transcripción, y secundariamente en el crecimiento y la respiración.

A dosis muy altas de rayos UV se forman también dímeros entre pirimidinas de las dos cadenas, es decir, se provocan entrecruzamientos de las dos hebras que igualmente afectan a la replicación y a la transcripción, aunque este tipo de daños reviste menos significación biológica.

El fotoproducto de la espora es la 5-timinil-5,6-dihidrotimina. Como vimos en el capítulo 12, se forma en la endospora bacteriana debido al alto grado de deshidratación, pudiendo ejercer igualmente efectos inactivantes.

Los hidratos de pirimidina (como la 6-hidroxi-5,6-dihidrotimina) se forman a altas dosis de luz UV. Tienen efecto mutagénico (no letal), favoreciendo la aparición de transiciones T=A a C=G.

Debido al carácter esencial del ADN como molécula central informativa de los seres vivos, la evolución ha desarrollado una serie de mecanismos capacitados para enfrentarse con los posibles daños ocasionados por la luz ultravioleta. Los principales mecanismos hallados en bacterias se pueden agrupar así:

1. Mecanismos prerreplicativos:
1. reparación fotoenzimática o fotorreactivación, que permite la reparación directa del daño en sí
2. reparación por escisión y resíntesis
2. Mecanismos posreplicativos:
1. reparación por recombinación
2. reparación inducible de emergencia (SOS)

Se debe a la actuación de una enzima denominada fotoliasa o enzima fotorreactivante, que muchas bacterias sintetizan de manera constitutiva. Las fotoliasas reparan directamente los dímeros de pirimidina, en una reacción que requiere luz visible de 300-500 nm de longitud de onda (luz azul). Estas enzimas poseen dos grupos prostéticos coloreados (cromóforos):

• flavina reducida (FADH₂)
• una pterina.

1. La primera fase del mecanismo es independiente de la luz. La fotoliasa reconoce el dímero de pirimidina, y se une a él, formando un complejo enzima-sustrato [E-S].
2. La flavina reducida (FADH₂) de la fotoliasa, en presencia de luz (l =300-500), se excita, y dona electrones al anillo de ciclobutano del dímero de pirimidina, rompiéndolo, y regenerando las dos pirimidinas sin alterar.

Aunque se sabe que el segundo cromóforo (la pterina) favorece la reparación, no está claro cuál es su papel exacto.

No todas las bacterias tienen enzimas fotorreactivantes, pero en cambio la fotorreparación está muy extendida entre eucariotas.

La distorsión en la doble hélice provocada por el dímero es reconocida por un complejo proteico con actividad de endonucleasa correctora, conocido como correndonucleasa o escinucleasa. El daño se repara indirectamente (es decir, no se actúa sobre el propio fotoproducto), sino que las bases dañadas se eliminan (se escinden) formando parte de un oligonucleótido, y el hueco resultante se rellena por resíntesis reparadora de ADN.

1. Un complejo formado por dos subunidades de la proteína UvrA y una de la UvrB (Uvr[A₂B]) se une cerca del dímero de pirimidina, usando la energía de la hidrólisis del ATP, y merced a su actividad helicasa, desenrolla localmente la doble hélice.
2. Se une la proteína UvrC, con lo que se completa el complejo Uvr[A₂BC], es decir, la correndonucleasa, unido a la cadena dañada del ADN, cerca del dímero.
3. La correndonucleasa realiza dos cortes en la cadena afectada por el dímero: corta el 8º enlace fosfodiéster "a la izquierda" del dímero (o sea, hacia el lado 5') respecto de la localización del dímero y corta el 4º o 5º enlace fosfodiéster "a la derecha" (en dirección 3' del dímero). Por lo tanto, se produce y libera un fragmento de unos 12 nucleótidos de longitud, que incluye al dímero de pirimidina, al mismo tiempo que se retira la escinucleasa, que se separa en sus polipéptidos constituyentes.
4. Queda, pues, un hueco de cadena sencilla en el ADN. Este hueco es ocupado ahora por la ADN-polimerasa-I y por la ADN-helicasa-II (codificada por el gen uvrD), que llevan a la síntesis de nuevo ADN para rellenar el hueco (por supuesto, en sentido 5'--->3'), tomando como molde la cadena intacta, y usando como cebador ("primer") el extremo 3'-OH que se había generado en la fase anterior.
5. Finalmente, la actuación de la ADN-ligasa sella la cadena (regeneración del enlace fosfodiéster del lado 5').

Cuando la ADN-polimerasa-III bacteriana (que es la enzima que normalmente replica el cromosoma) se encuentra, en la cadena que está usando como molde, con un dímero de pirimidina, deja de replicar esa zona, y "salta" unos 1000 nucleótidos más adelante para seguir la replicación. Por lo tanto, deja un gran hueco o mella de unos 1000 nucleótidos. Esta discontinuidad (llamada mella post-replicativa) se puede rellenar por el mecanismo de reparación por recombinación general, recurriendo a la proteína RecA, que verifica una recombinación con la hebra parental homóloga intacta (veremos más detalles de esta recombinación en el capítulo 24).

1. Numerosas unidades de proteína RecA recubren la zona de cadena sencilla de la mella posreplicativa, formando estructuras helicoidales.
2. La proteína RecA promueve emparejamiento homólogo de la cadena sencilla a la que recubre con la doble cadena "hermana" intacta.
3. Se produce un intercambio recíproco de cadenas.
4. El extremo 3'-OH libre de la cadena dañada (que merced al intercambio recíproco está ahora emparejada con la cadena complementaria procedente de la doble hélice "hermana") sirve de cebador a la ADN-polimerasa-I, que sintetiza ADN nuevo usando como molde la cadena complementaria intacta del dúplex.
5. Ligación e isomerización espontáneas, que produce la llamada "estructura de Holliday", una figura en "X" donde hay dos sobrecruzamientos ("crossing-over") que mantienen unidos entre sí a los dos duplex.
6. Resolución de los dos sobrecruzamientos por sendas roturas y religaciones, lo cual genera dos dobles hélices ininterrumpidas. Como se ve en la figura, uno de estos dúplex lleva el dímero de pirimidina, y el otro es una doble cadena intacta, aunque parte de ella contien ADN de nueva síntesis.

Como se puede ver, el mecanismo de reparación por recombinación no repara por sí mismo la lesión en el ADN, pero logra reparar la mella postreplicativa, evitando que se detenga la replicación del cromosoma. Al final del proceso el dímero como tal sigue sin reparar, pero ahora tendrá una oportunidad de ser reparado por algún otro mecanismo, como el de escisión-resíntesis.

Cuando la bacteria se somete a dosis elevadas de luz UV o a determinados agentes químicos que dañan severamente el ADN, o que interfieren seriamente con la replicación, puede ocurrir que los sistemas de reparación que hemos visto hasta ahora no sean suficientes para reparar todos los daños; en estas circunstancias se pone en marcha un nuevo mecanismo, que es inducible y que calificamos como de emergencia, ya que tiende a salvaguardar la viabilidad de la célula, a costa de acumular mutaciones con frecuencia elevada (y por eso lo llamamos también propenso a error).

El sistema SOS en realidad consiste en una serie de funciones "de emergencia" ante estrés, una de las cuales es este tipo de reparación de ADN propenso a error. Otras funciones del sistema SOS son:

 

• Inducción de varios profagos (lo veremos en la sección de Virología, al tratar el fago l).

 

• Retraso en la formación del tabique transversal, por lo que las células se alargan anormalmente. (El significado adaptativo de esta respuesta de inhibición de la septación parece ser el impedir la segregación de ADN sin reparar a la célula hija, lo que podría ocasionarle la muerte).

 

• Desconexión de la respiración.

 

• Incremento de la degradación de proteínas.

El gen lexA posee un nivel basal de expresión, de modo que codifica la proteína LexA, que actúa como represor sobre su propio gen (represión autógena), así como sobre los genes recA, uvrA, B, C, umuDC. La represión no es total, sino que se da un nivel basal de producción de los polipéptidos correspondientes a estos genes. Así, por ejemplo, el nivel de proteína RecA es suficiente para efectuar los procesos normales de recombinación, y los niveles de UvrABC son suficientes para reparar pequeños daños en el ADN.

Una célula seriamente afectada por un agente que daña el ADN o interfiere con su replicación poseerá zonas de cromosoma con ADN de cadena sencilla (c.s.) sin reparar. Pues bien, este ADN de c.s. constituye una señal de situación de emergencia para la proteína RecA: dicha proteína se une a esas regiones de c.s., de modo que adquiere una actividad proteasa muy específica (para distinguir esta actividad, usamos la nomenclatura RecA*). La proteína RecA* (activada como proteasa) induce la proteolisis del represor LexA (rompiéndolo entre dos aminoácidos concretos hacia la mitad de la molécula). Por lo tanto, ya no hay suficiente proteína LexA intacta como para seguir reprimiendo a los genes citados (recA, uvrABC, umuDC). Dichos genes (llamados genéricamente genes SOS) se pueden expresar ahora a altos niveles, de modo que:

• Aumentan los niveles de RecA, lo que conlleva un aumento de la eficiencia de la reparación por recombinación;
• Aumentan los niveles de la escinucleasa (Uvr[A₂BC]), lo que supone mejorar la reparación por escisión-resíntesis;
• Se expresan los genes umuDC, lo que se traduce en un aumento de la mutagénesis. Pero )por qué aumenta la mutagénesis? El mecanismo exacto no está claro. Se sabe que en esta situación de emergencia algunos dímeros de pirimidina son procesados con la intervención de los productos de recA y de umuD y umuC, de modo que hay una síntesis de emergencia de ADN que acarrea la frecuente introducción de bases incorrectas (es decir, es un proceso de reparación propenso a error).

Hay dos hipótesis principales sobre este respecto:

1. Los genes umuD,C codificarían una nueva polimerasa de emergencia con menor fiabilidad de copia que las polimerasas habituales;
2. O bien, los productos de umuDC modificarían alguna polimerasa normal (como la ADN-pol-III) de manera que ésta "relajaría" su capacidad correctora de pruebas (exonucleasa 3' à 5'), de modo que ante ausencia de molde, o ante un molde afectado por el daño colocaría nucleótidos "al azar", lo que sería la base de las frecuentes mutaciones.

Hay pruebas que favorecen a esta segunda hipótesis.

De esta manera, la célula salvaría su integridad en esta situación "límite", pero a costa de adquirir frecuentes mutaciones.

La luz UV se puede producir artificialmente en lámparas de vapor de mercurio de baja presión, que emiten el 90% de su radiación a 254 nm. La unidad de energía de radiación se mide en watts/(seg·cm²).

Por ejemplo, una lámpara de 15 watios emite una energía de 38m watts·cm^-2·seg^-1, a una muestra situada a 1 metro de la lámpara.

La luz UV es efectiva sobre bacterias Gram-positivas y Gram-negativas. La dosis letal para células vegetativas suele estar entre 1800 y 6500 m watt·cm^-2, pero las endosporas requieren 10 veces más dosis.

El uso práctico de la luz UV como agente esterilizante está limitado, ya que tiene poco poder penetrante: no entra en objetos sólidos, y además se ve apantallada por el cristal y penetra poco en los líquidos. Su aplicación concreta más frecuente es en el control de infecciones por vía aérea: lámparas de desinfección en salas de hospitales y de laboratorios de investigación. En Microbiología se emplea la luz UV como agente mutagénico en bacterias (en muchos estudios que requieran obtener mutantes correspondientes a cualquier tipo de fenotipos, para conocer las correspondientes bases genéticas).

A diferencia de la UV, la luz visible es de baja energía, y además, sus cuantos no tienen efectos selectivos sobre el ADN, por lo que no sería de esperar, en principio, que este tipo de radiación tuviera efectos negativos sobre las bacterias. Sin embargo, la luz visible puede ejercer un efecto negativo indirecto, en el fenómeno de sensibilización fotodinámica.

La luz visible de fuerte intensidad (p. ej., exposición a pleno sol) es capaz de matar las bacterias, debido a que ciertas moléculas de éstas (riboflavinas, porfirinas, citocromos) absorben la energía de los cuantos y se excitan durante 10^-6-10^-8 seg, tras lo cual reemiten la energía a otras moléculas, originando fotooxidaciones en residuos His y Trp de las proteínas y en las bases de los ácidos nucleicos. También se puede generar oxígeno singlete (¹O₂), que es un radical muy reactivo, oxidante, que puede destruir la célula con rapidez.

Así pues, en la práctica de laboratorio habitual, no es conveniente exponer las bacterias en cultivo a la luz, sino que habrán de cultivarse en oscuridad (salvo el cultivo de las bacterias fototrofas).

Ciertas bacterias (entre ellas las fotosintéticas, y las que se propagan vía aérea) poseen abundantes pigmentos de tipo carotenoide que las protegen de estos efectos fotosensibilizadores. (Los carotenoides captan la energía del oxígeno singlete y la reenvían al estado basal, no excitado).

Si a una suspensión de bacterias añadimos ciertos pigmentos artificiales fluorescentes (colorantes), como el rosa de Bengala, el azul de metileno, la eosina, etc, la energía del visible absorbida por dichos pigmentos no la reemiten como fluorescencia, sino que provoca cambios en proteínas y ácidos nucleicos. Esto conduce a efectos de esterilización, sobre todo por desnaturalización de proteínas.

Las ondas sonoras audibles para los humanos poseen un rango de frecuencias entre los 9 kilociclos y los 20 kilociclos/segundo. Por encima de 20 Kc se sitúan las ondas supersónicas (hasta los 200 Kc/seg) y las ultrasónicas (desde 200 hasta 2000 Kc/seg). Estos tipos de ondas de frecuencias superiores a las audibles (sobre todo las ultrasónicas) tienen el efecto de desintegrar las células.

El fundamento de esta acción es el siguiente: el paso del sonido a través de un líquido produce cambios de presión alternantes (por los sucesivos frentes de ondas), que a grandes frecuencias originan cavidades (burbujas de gases disueltos) de unos 10 m m de diámetro (fenómeno de cavitación). Dichas cavidades van aumentando de tamaño y terminan colapsando violentamente, dando lugar a enormes presiones locales (de hasta 1000 atmósferas o 10 Tm/cm²). Las consecuencias del colapso son:

• la célula se desintegra;
• si existe oxígeno en el líquido de suspensión, se forman peróxidos (como el H₂O₂);
• despolimerización de macromoléculas;
• cortes en ambas hebras del ADN.

Las bacterias son variables en cuanto a su susceptibilidad a las vibraciones sonoras. En general, son más sensibles las Gram-negativas y más resistentes las Gram-positivas. Sin embargo, ante un tratamiento por ultrasonidos siempre cabe la posibilidad de que sobrevivan algunos individuos, por lo que este método no tiene utilidad para la esterilización.

El uso habitual de los supra- y ultrasonidos en laboratorio es para la llamada "sonicación" o disrupción ultrasónica de células para obtener extractos celulares, en investigaciones bioquímicas. El tratamiento se realiza en un aparato llamado generador de ultrasonidos o "sonicador", que opera en un rango de frecuencias desde 9 hasta 100 Kc/seg.

La mayor parte de las especies bacterianas de hábitats continentales no pueden crecer (e incluso mueren) cuando son sometidas a altas presiones (unos 600 Kg/cm²). Ello se debe a los siguientes efectos adversos:

• aumento de la viscosidad del citoplasma;
• disminución de la capacidad de las enzimas de unirse a sus respectivos sustratos;
• (posiblemente) interferencia en procesos de transporte a nivel de membrana;
• (posiblemente) interferencia en la biosíntesis de proteínas;
• interferencia en la división celular: las bacterias se alargan, se filamentan, pero sin producción de tabique transversal (crecimiento sin división celular).

Sin embargo, existen bacterias (sobre todo marinas) que toleran o requieren altas presiones (barotolerantes y barófilas, respectivamente):

Bacterias barotolerantes:

Crecen a la presión atmosférica, pero aguantan hasta unas 500 atmósferas. Su hábitat son las aguas oceánicas, entre los 2000 y los 4000 metros de profundidad.

Bacterias barófilas:

Crecen óptimamente a más de 400 atmósferas. Podemos distinguir entre barófilas moderadas (facultativas) y barófilas extremas (obligadas):

Las barófilas moderadas son aquellas bacterias que pueden crecer a presión atmosférica, aunque su óptimo está a unas 400 atmósferas. Habitan profundidades entre los 5000 y 7000 metros.

Las barófilas extremas presentan óptimos de crecimiento a muy altas presiones (por encima de 600-700 atmósferas), y son incapaces de crecer a presión atmosférica. Se han llegado a aislar a más de 10000 metros de profundidad. Debido a que a esas profundidades la temperatura del agua es de sólo 2-3^oC, suelen ser simultáneamente criófilas. Este tipo de bacterias está empezando a ser investigado actualmente, y su manejo es engorroso, ya que hay que cultivarlas en cámaras especiales presurizadas que suministran las altas presiones que requieren.

La llamada prensa de French (que frecuentemente se denomina incorrectamente como prensa francesa) es un aparato de laboratorio que permite aplicar grandes presiones y brusca descompresiones, lo que logra la rotura mecánica de las bacterias, con objeto (al igual que la sonicación) de obtener extractos libres de células.

(Repasar en el capítulo 16, el concepto de potencial de agua o actividad de agua, a_w)

Exceptuando los micoplasmas, que carecen de pared celular, las bacterias pueden vivir en medios tanto hipotónicos como hipertónicos, debido a la protección de una pared celular rígida y a la membrana citoplásmica semipermeable.

Normalmente el citoplasma de las bacterias poseen una osmolaridad ligeramente superior a la del entorno, lo que garantiza el paso de agua al interior. La presión de turgor es relativamente constante porque la membrana citoplásmica se topa con la rigidez de la pared celular. Esta presión de turgor permite que la bacteria aguante cambios bruscos de concentración de solutos en su entorno (dentro de ciertos límites). Pero esto plantea una pregunta (que intentaremos responder a continuación): ¿cómo logra la bacteria ajustar su osmolaridad interna a esos cambios exteriores?

A) En medios hipotónicos (con una a_w>a_w del citoplasma) es la pared celular la que ejerce todo el papel: su rigidez se opone a la entrada de agua, y por lo tanto, evita que la membrana citoplásmica tienda a sufrir una presión de turgor excesiva.

Recordemos que las bacterias Gram-negativas poseen dos compartimentos acuosos: el citoplasma y el periplasma. Como se dijo oportunamente (capítulo 5), en el periplasma existe un oligosacárido especial, derivado de la membrana (el MDO, consistente en 6-10 unidades de ß-D-glucosa unidas por enlaces ß(1à 2), y con residuos de fosforilcolina y fosfatidil-etanolamina), que interviene en regular la osmolaridad. Sus grupos negativos están contrarrestados por contraiones positivos, que igualmente colaboran en la regulación osmótica.

En un medio con baja osmolaridad (p. ej., aguas fecales) aumenta la concentración del MDO, lo cual supone un aumento de la osmolaridad del periplasma, que presiona contra el peptidoglucano. De esta manera la presión de turgor del protoplasto se transmite al periplasma y de él al peptidoglucano, que es la estructura más resistente.

B) En medios hipertónicos (cuando la a_w del exterior es menor que la del citoplasma). Las bacterias poseen mecanismos compensatorios por los que tienden a aumentar la osmolaridad interior por encima de la del medio (para garantizar la entrada de agua del ambiente y mantener su metabolismo). Ello se logra esencialmente aumentando la concentración de un soluto muy soluble en agua en el interior celular, soluto llamado genéricamente soluto compatible, lo cual se puede lograr por varios posibles mecanismos:

• bombeando iones al interior;
• sintetizando una molécula orgánica osmóticamente activa;
• bombeando sustancias osmoprotectoras.

1. En el caso de los iones, el ión bombeado suele ser el potasio (K⁺), por un sistema de antiporte K⁺/H⁺. Ahora bien, para que no se desequilibre la fuerza iónica, la entrada de K⁺ suele ir en paralelo con una salida de otros cationes, que suelen ser poliaminas (como la putrescina). Se ha propuesto que existe un sistema de antiporte K⁺/putrescina que en ciertas bacterias tiende a mantener la fuerza iónica mientras aumenta la tonicidad interior, como sistema para compensar la alta tonicidad del medio. La señal que desencadena el transporte de iones potasio es directamente la presión de turgor de la membrana y no la osmolaridad externa.
2. Como ejemplos de síntesis de solutos orgánicos compatibles y osmóticamente activos tenemos el glutamato, la glutamina y la trehalosa.

Muchas bacterias Gram-negativas sintetizan glutamato ante grandes concentraciones extracelulares de iones Na⁺. El mecanismo es el siguiente: al añadir grandes cantidades de Na⁺, se produce un eflujo (salida) de H⁺ al exterior de la célula, lo que supone la alcalinización del citoplasma. En estas condiciones se activa la enzima glutamato-deshidrogenasa (GDH), que sintetiza grandes cantidades de glutamato, que funciona como soluto compatible que equilibra la osmolaridad del medio.

En ciertas enterobacterias lo que ocurre es una inhibición del uso metabólico del glutamato, por lo que este se acumula.

Igualmente se da una acumulación de trehalosa por inducción de una ruta biosintética e inhibición de la ruta catabólica.

La ectoína es un derivado cíclico de la prolina, sintetizado como soluto compatible por ciertas anoxifotobacterias purpúreas.

Ahora bien, si el medio es muy hipertónico, estos mecanismos ya son incapaces de evitar la salida de agua desde el citosol, lo cual conlleva una retracción de la membrana citoplásmica. La pérdida de agua puede suponer la deshidratación del citoplasma, lo que conlleva la detención del crecimiento.

• En Gram-positivas se produce una plasmolisis auténtica (retracción de la membrana citoplásmica respecto de la pared rígida suprayacente)
• En Gram-negativas no existe auténtica plasmolisis, ya que la pared celular y la membrana citoplásmica se retraen al mismo tiempo. Las bacteria entéricas crecen lentamente por encima de 0.65M de NaCl.

3. Sin embargo, las bacterias pueden crecer a osmolaridades superiores a la máxima teórica, si en el medio existen determinados compuestos llamados osmoprotectores. La bacteria bombea esos compuestos a su interior, usándolos como solutos compatibles.

Ejemplos de osmoprotectores:

• Prolina (p. ej., en Salmonella typhimurium y Staphilococcus aureus)
• Betaína (glicínbetaína), un derivado trimetilado de la glicocola (en cianobacterias y en algunas Gram-positivas).
• Colina (en Escherichia coli).
• Ectoína en enterobacterias.

Por ejemplo, S. typhimurium crece muy lentamente en 1M de ClNa, pero mejora si al medio se añade 1mM de prolina. Un método normal de aislar S.aureus es comprobar el crecimiento en medio con 7.5% de ClNa en presencia de prolina.

Algunas bacterias han desarrollado evolutivamente sistemas inducibles de transporte de estas sustancias, muy eficaces para garantizar su utilización como solutos compatibles. Es el caso de la colina en E. coli, que una vez introducida se metaboliza hasta el auténtico soluto compatible, la glicínbetaína.

Algunas bacterias patógenas, al destruir tejidos de su hospedador, provocan la liberación de sustancias, algunas de las cuales les sirven como osmoprotectores ante la alta osmolaridad de los fluidos corporales.

Otro mecanismo de control ante variaciones de presión osmótica presente en algunas bacterias Gram-negativas, es la variación en la proporción de porinas de membrana externa (repasar cap. 5, apartado 2.7.1).

Existen ciertos microorganismos especializados que viven en medios hipertónicos, y en general se llaman osmófilos. Entre los osmófilos podemos distinguir los sacarófilos y los halófilos.

Uno de los ejemplos de microorganismos sacarófilos no es una bacteria, sino las levaduras, que viven en jugos vegetales, néctares, zumos, etc. Utilizan como solutos compatibles polioles como el sorbitol, el ribitol, etc.

Entre los organismos halófilos, podemos distinguir los halófilos moderados y los halófilos extremos o hiperhalófilos.

Halófilos moderados: suelen ser bacterias marinas que viven en 3.5% de NaCl, y que ven inhibido su crecimiento a concentraciones mayores o menores de sales. Los halófilos moderados tienen requerimientos concretos de una a_w equivalente a la de agua de mar, así como concentraciones determinadas de iones Na⁺. El papel jugado por este Na⁺ es:

• mantenimiento de los sistemas de membrana citoplásmica y transporte;
• estabilización de la pared celular;
• requerimiento por parte de muchas enzimas.

Halófilos extremos (hiperhalófilos), representados paradigmáticamente por las arqueas de la familia Halobacteriaceae (halobacterias), que viven en (y de hecho requieren) concentraciones saturantes de sales (salitrales, lagunas salinas). Usan como soluto compatible el K⁺, concentrándolo a partir del medio donde viven, hasta que el citoplasma queda prácticamente saturado con él (4 a 7 M). Esta gran concentración de potasio es esencial para mantener la estabilidad y actividad de sus ribosomas, enzimas y sistemas de transporte. Pero las estructuras superficiales de estas arqueas requieren altas concentraciones de cloruro sódico.

Dejando aparte las bacterias halófilas, hay algunas bacterias halotolerantes (como por ejemplo, S. aureus), pero la inmensa mayoría de los procariotas viven a valores de actividad de agua de 0.98. Por ello, un método que ya se conocía empíricamente en la antigüedad para conservar ciertos alimentos era el desecarlos o salarlos, o añadirles grandes cantidades de azúcar (como en las mermeladas).

La mayoría de las bacterias pueden crecer dentro de un margen de pH de su medio, manteniendo al mismo tiempo su pH interno óptimo prácticamente constante.

Por ejemplo, Escherichia coli puede crecer bien entre pH 6 y pH 8, pero su pH interno es siempre 7.6 o muy cercano a ese valor.

Respecto del margen normal de pH a los que crecen las bacterias, éstas se pueden clasificar en:

• Neutrófilas, si crecen de modo óptimo en torno a la neutralidad (entre pH 5.5 y 8.
• Acidófilas, si crecen normalmente entre pH 0 y pH 5.
• Alcalófilas, si crecen entre pH 8.5 y pH 11.5.

La mayor parte de las bacterias son neutrófilas. Muchas bacterias neutrófilas modifican el pH del medio, y resisten entornos relativamente ácidos o alcalinos. Por ejemplo, algunas bacterias fermentativas excretan ácidos, mientras otras alcalinizan el medio, p. ej., produciendo amonio a partir de desaminación de aminoácidos.

Aunque los microorganismos pueden crecer en un margen más o menos amplio de pH (alrededor de un óptimo), los cambios bruscos pueden ser lesivos (afectando a la membrana y al transporte de solutos, e inhibiendo enzimas). Si el pH citoplásmico cae rápidamente hasta 5 o menos, la bacteria puede morir.

Uno de los mecanismos que, al menos en neutrófilos parece controlar el pH interior es un sistema de antiporte H⁺/K⁺: a pH ácidos, el interior celular puede quedar en principio más alcalino que el exterior. Este sistema introduce protones en el interior y saca iones potasio. De esta manera neutralizan el pH interior y siguen teniendo un potencial de membrana para establecer una fuerza protón motriz que les suministre energía.

Si el pH interior cae en torno a 6 o 5.5, bacterias como E. coli o S. typhimurium inducen una respuesta de tolerancia a ácidos, consistente en ATPasas translocadoras de protones (expulsan protones al exterior) y chaperonas (proteínas celadoras) para corregir las proteínas desnaturalizadas.

Existen algunos notables procariotas cuyo pH óptimo es muy bajo (acidófilos extremos u obligados): Algunas eubacterias del género Thiobacillus (T. thiooxidans, T. ferrooxidans) y las arqueas del género Sulfolobus tienen su óptimo a pH 2, y generan ellas mismas estos bajos pH al oxidar sulfuros hasta ácido sulfúrico. (Sulfolobus es un notable ejemplo de procariota extremófilo: su hábitat son fuentes termales ácidas y solfataras: es un termoacidófilo). De hecho, estas bacterias necesitan esas altas concentraciones de H⁺ para mantener la integridad de sus membranas y envueltas: a pH neutro esas envueltas se desintegran.

Las especies alcalófilas obligadas tienen óptimos de pH en torno a 10-11. Por ejemplo, Bacillus alcalophilus , cuyo pH interno es de 9. Sus hábitats típicos son suelos carbonatados y lagunas alcalinas (algunos son también halófilos, como Natronobacterim gregoryi).

HOWARD-FLANDERS, P. (1982): Reparación inducible del ADN. Inv. y Ciencia 64 (enero): 28-37.

MADIGAN, M.T., B.L. MARRS (1997): Extremófilos. Inv y Ciencia 249 (junio): 60-66.

RADMAN, M., R. WAGNER (1988): Fidelidad en la duplicación del ADN. Inv. y Ciencia 145 (octubre): 20-29.

CSONKA, L.N., W. EPSTEIN (1996): Osmoregulation. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1210-1223.

CSONKA, L.N., A.D. HANSON (1991): Prokaryotic osmoregulation: genetics and physiology. Annu. Rev. Microbiol. 45: 569-606.

DEMMING, J.W. (1987): Ecological strategies of barophilic bacteria in the deep ocean. Microbiol. Sci. 3: 205-211.

F.E.M.S. (1996): Extremophiles. Número especial de la revista FEMS Microbiology Reviews, 18 (mayo).

FOSTER, J.W. (1992): Beyond pH homeostasis: the acid tolerance response of Salmonellae. ASM News 58: 266-270.

HARRISON Jr., A.P. (1984): The acidophilic thiobacilli and other acidophilic bacteria that share their habitat. Ann. Rev. Microbiol. 38: 265-292.

INGRAHAM, J.L., A.G. MARR (1996): Effect of temperature, pH and osmotic stress on growth. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1570-1578.

KRULWICH, T.A., A.A. GUFFANTI (1989): Alkalophilic bacteria. Ann. Rev. Microbiol. 43: 435-463.

KUSHNER, S.R. (1987): DNA repair. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology". (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology. Washington, D.C. (1987), págs. 1044-1053.

LINDAHL, T., B. SEDGWICK, M. SEKIGUCHI, Y. NAKABEPPU (1988): Regulation and expression of the adaptative response to alkilating agents. Ann. Rev. Biochem. 57: 133-157.

MATIN, A., E.A. ANGER, P.H. BLUM, J.E. SCHULTZ (1989): Genetic basis of starvation survival in nondifferentiating bacteria. Ann.Rev. Microbiol. 43: 293-316.

MILLER, K.J., J.M. WOOD (1996): Osmoadaptation by rhizosphere bacteria. Annu. Rev. Microbiol. 50: 101-136.

RUPP, W.D. (1996): DNA repair mechanisms. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 2277-2294.

SANCAR, A., G.B. SANCAR (1988): DNA repair enzymes. Ann. Rev. Biochem. 57: 29-67.

SANCAR, G.B., A. SANCAR (1987): Structure and function of DNA photolyases . Trends Biochem. Sci. 12: 259-261.

SLONCZEWSKI, J.L., J.W. FOSTER (1996): pH-regulated genes and survival at extreme pH. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1539-1550.

WALKER, G.C. (1996): The SOS response of Escherichia coli. En: "Escherichia coli and Salmonella typhimurium. Cellular and molecular biology", 2ª edición (F.C. Neidhart, ed.). American Society for Microbiology Press. Washington, D.C., págs. 1400-1416.

ZACCAI, G., H. EISENBERG (1990): Halophilic proteins and the influence of solvent on protein stabilization. Trends Biochem. Sci. 15: 333-337.

Ó 1998 ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. Prohibida su reproducción, salvo con fines educativos. Se agradecen los comentarios y sugerencias. Escríbame a eianez@goliat.ugr.es