Capítulo 5
Crecimiento bacteriano | Estequiometría del crecimiento microbiano | Microorganismo promedio | Balance de Carbono | Cinética de crecimiento | Consumo de sustrato | Mantenimiento celular | Requerimiento de oxígeno | Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento | Lecturas recomendadas
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CRECIMIENTO MICROBIANO
Cuando se siembran microorganismos en un medio de cultivo apropiado, los mismos comienzan a dividirse activamente empleando los nutrientes que le aporta el medio de cultivo para "fabricar" nuevos microorganismos. Este proceso continúa hasta que algún nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato limitante) y el crecimiento se detiene. También puede detenerse el crecimiento por acumulación de alguna substancia inhibidora formada por los mismos microorganismos, pero supóngase por ahora que éste no es el caso y que la primera alternativa es la válida. Luego hay dos aspectos claramente diferenciables que hacen al crecimiento microbiano: uno estequiométrico, por el cual la concentración final de microorganismos obtenidos dependerá de la concentración y composición del medio de cultivo, y el otro cinético, el que dirá con qué velocidad se lleva a cabo el proceso. Estequiometría del crecimiento microbiano
La aplicación de la
estequiometría requiere conocer los rendimientos. Estos se definen como
la relación entre el producto obtenido y el sustrato consumido
(usualmente la fuente de carbono y energía). Por ejemplo el rendimiento
celular se define como:
X y S representan la concentración de biomasa y sustrato respectivamente. En la práctica, para el cálculo del Yx/s se emplea la expresión:
En el capítulo 4 se vio que para obtener 30 gl-1 de levadura para panificación, se consumían 60 gl-1 de fuente carbonada, luego el rendimiento será
Si además de microorganismos se forma algún producto en particular, el rendimiento en producto estará dado por:
Antes de avanzar en el tema, convendrá hacer algunas consideraciones sobre la composición elemental de los microorganismos con respecto a los elementos mayoritarios (C, N, H, O) ya que la misma será el punto de partida para realizar los cálculos estequiométricos. Además, y antes de aplicar los balances estequiométricos deberemos responder a esta pregunta: ¿qué peso de células (o biomasa) corresponde a "un mol"?. Se ha encontrado que la composición elemental de un microorganismo dado durante un cultivo no se modifica mayormente y, lo que es más, las composiciones elementales de distintos tipos de microorganismos (bacterias y hongos) son semejantes. De este modo se puede definir un "microorganismo promedio" como aquél cuya composición es (% p/p): C = 46.5; H = 6.49; 0 = 31.0; N = 10.85, siendo el contenido de sales aproximadamente 5%. Es importante recalcar que si bien la composición elemental de la biomasa se mantiene constante durante el cultivo, no ocurre lo mismo con la composición macromolecular, esto es: proteínas, ácidos nucleicos, cte., la cual puede variar sensiblemente. Teniendo en cuenta la composición media anterior, es posible escribir la "fórmula mínima" de un microorganismo promedio como: CH1.79O0.5N0.2 (en la que está representado el 95% p/p de la biomasa) y con fines netamente prácticos definir "un C-mol de biomasa" como la cantidad de biomasa que contiene un átomo gramo de Carbono.
Por tanto una concentración de X en gl -1 de biomasa es equivalente a X / 25.8 C-mol de biomasa l -1, o bien Xox / 12 C-mol de biomasa l -1 . Donde ox es la fracción de Carbono de la biomasa (0.465 para el "microorganismo promedio"). Esta última forma de calcular los C-moles de biomasa es ventajosa ya que sólo requiere conocer ox ; un dato que se puede obtener fácilmente de la bibliografía. En caso de no existir datos disponibles, se puede suponer ox = 0.465 sin temor a cometer errores groseros. De forma análoga a la anterior se definen 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, y también 1 C-mol de producto. Por ejemplo para la glucosa (C6H12O6) 1 C-mol de glucosa estará representado por CH20 y pesará 30 g, mientras que 1 C-mol de etanol (C 2H60) estará representado por CH 300.5 y pesará 23 g. En general para un compuesto de la formaC n H 1 Oq Nm , 1 C-mol estará representado por C H1/n Oq/n Nm/n. En base a lo anterior, el crecimiento puede representarse mediante la siguiente "reacción química", en la que supondremos que el NH 3 (o alguna sal de amonio) es la fuente de nitrógeno:
Debe notarse que en esta ecuación todos los coeficientes estequiométricos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía (fuente C y E). El valor de yx/s representa los C-moles de biomasa formada por cada C-mol de fuente de C y E consumida, el de b los moles de 02 consumido por cada C-mol de fuente de C y E consumida, etc. Ya se ha visto que Yx/s e Yp/s son los rendimientos en biomasa y en producto respectivamente. Son parámetros de importancia fundamental dentro de la microbiología industrial, pues dan una medida de la eficiencia del proceso de producción. De este modo en un proceso destinado a la producción de biomasa, el objetivo será maximizar Y x/s y minimizar Yp/s . Si lo que interesa es el producto, se tendrá el caso inverso. Los valores de yx/s e yp/s se calculan a partir de Yx/s e Yp/s mediante las expresiones:
Antes de efectuar los balances de materia y energía, introduciremos un nuevo concepto que nos permitirá simplificar los cálculos: el "grado de reducción" al que denotaremos con la letra y. Un par de ejemplos servirán para aclarar el significado de y. En la tabla 4 pueden observarse los valores de y para la oxidación de 1 C-mol de distintos compuestos orgánicos a C02 y H2O, como así también el calor de reacción.
De la tabla 4 surge que: 1) El valor de y corresponde al número de electrones que fueron transferidos desde el compuesto a oxidar, al O2 , tomando como base 1 C-mol. Por tanto expresa el número de "electrones disponibles" por cada C-mol. 2) La cantidad de calor liberado por cada mol de electrones transferidos al oxígeno (q/y), se mantiene prácticamente constante. Del análisis de un gran número de compuestos resulta un valor promedio de qo = 27.5 k cal (mol electrones transferidos al O2)-1 De la conjunción de ambos puntos resulta que el valor de y es una medida de la energía contenida en un compuesto. Así, por ejemplo, 1 C-mol de etanol brinda más energía que 1 C-mol de glucosa. En general para calcular el
grado de reducción de un compuesto se plantea la ecuación
de oxidación del mismo a C02 y H2O, y el valor de
y se obtiene multiplicando por 4 el coeficiente estequiométrico del O2
(ver tabla 4). Si el compuesto contiene
nitrógeno, deberá especificarse cuál será el estado de oxidación
final de éste. Por ejemplo,
supongamos un compuesto dado por La ecuación de oxidación será:
La ecuación (7) es muy útil ya que permite calcular y sin necesidad de plantear la ecuación de oxidación. Debe quedar claro que tanto para el CO2, como el H2O y el NH3 es y = 0 (no tienen electrones disponibles) por ser éste el nivel de referencia elegido. Si en lugar de NH3 , hubiésemos elegido N2 , se demuestra fácilmente que para ese caso y = 4 + a - 2b. La elección del nivel de referencia es tan sólo una cuestión de conveniencia. Con todos estos elementos estamos en condiciones de aplicar balances de materia y energía a la "reacción química" que representa al cultivo. Para simplificar el tratamiento supondremos que la fuente de C y E no contiene nitrógeno (es lo usual) y que la fuente de nitrógeno es una sal de amonio, por lo que y estará dado por la ecuación (7).
Puesto que los rendimientos están referidos a 1 C-mol de fuente de Carbono y energía, resulta
II. Balance de grado de reducción: Los electrones disponibles a la izquierda y a la derecha de la reacción deberán ser iguales, luego:
Debe recordarse que para el NH3 , H2O y C02 es y = 0. Además el grado de reducción del O2 es -4. Reordenando la ecuación (9) queda:
q = 4 b qo (k cal / C-mol fuente de C y E) (15) De acuerdo con esto, e representa la fracción de energía disipada como calor. Mediante las ecuaciones (8) y (10) es posible analizar los resultados experimentales y verificar si las determinaciones han sido correctas. Medidas realizadas en el laboratorio deberán encontrarse dentro de los siguientes intervalos:
Cuando se tiene certeza en las determinaciones, es posible aplicar las ecuaciones para calcular algún rendimiento que no ha sido medido, por ejemplo yp/s en base a los demás. Veremos seguidamente algunos ejemplos: Ejemplo 1: Se cultivó la levadura Candida utilis en un medio conteniendo glucosa, SO4(NH4) 2 y sales. La concentración inicial de microorganismos fue de 0.53 g l -1 (Xo) y la glucosa 15.2 g l -1 (So ). Al cabo de 9.5 horas, se consumió totalmente la glucosa (Sf = 0), se consumieron 0.123 mol de O2 l-1 , se produjeron 0.179 mol de C02 l -1 y la biomasa alcanzó un valor de 6.07 g l -1 (Xf). Se desea averiguar si, además de biomasa, se formó algún producto. Como no se dispone de datos relativos a la composición elemental de C. utilis,se supone que ésta es cercana a la del "microorganismo promedio".
Del mismo modo se tiene que yco2/s = 0.354. Puesto que la suma de ambos rendimientos es muy inferior a 1, es evidente que se ha formado algún producto cuyo rendimiento será:
Para aplicar la ecuación (10) se requiere antes calcular el grado de reducción de la biomasa (y.) y de la glucosa (v s), para lo cual se emplea la ecuación (7).
Además el valor de b será: b = 0.243 mol 02 . C - mol-1 Luego se calcula
Nuevamente la suma es inferior a 1 y de la ecuación (10) resulta:
Este resultado confirma que se ha formado algún producto, pero además se puede estimar cuál es el valor de yp .
Tratándose de una levadura es probable que el producto formado sea etanol, cuyo gp es 6, y si bien el valor obtenido es inferior a éste, debe tenerse en cuenta que para los cálculos se empleó la fórmula mínima del "microorganismo promedio" y no la de Candida utilis en particular. Ejemplo 2: Calcular la cantidad de calor generado cuando se producen 100 g de levadura para panificación. De acuerdo a la estequiometría vista en el Capítulo 4, por cada 100 g de levadura formada se consumen 3.1 mol O2 . Luego el calor generado en éste caso será 3.1 x 4 x 27.5 = 342 k cal, valor muy cercano al dado por la ecuación de Harrison.
Debido a la naturaleza autocatalítica del crecimiento microbiano, es lógico suponer que la concentración de microorganismos, X, influye en la velocidad con que aumenta la población, rx Así:
En esta ecuación, p es la velocidad específica de crecimiento, la cual para un tipo de microorganismo dado depende principalmente de la composición y concentración del medio de cultivo, presencia de inhibidores, temperatura y pH. Existen diversas expresiones para p: la más difundida es la ecuación de Monod, que relaciona el valor de m con la concentración de un componente del medio de cultivo que está en defecto respecto de los requerimientos del microorganismo: el sustrato limitante.
donde S es la concentración de sustrato limitante, um es la velocidad de crecimiento específica máxima, y Ks se conoce como constante de saturación. El valor de Ks está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el sustrato. Cuando S » Ks, m toma el valor de mm y rx sólo depende de X. En general Ks tiene valore muy bajos, del orden de los mg l -1 , por tanto concentraciones relativamente bajas de S son suficientes para hacer que m=mm . En promedio las bacterias poseen valores de mm cercanos a 0.9 h-1 , las levaduras 0.45 h-1 y los hongos filamentosos 0.25 h-1 ; de todos modos mm debe ser determinado experimentalmente para cada caso en particular. La presencia de inhibidores del crecimiento en el medio de cultivo causa disminución en el valor de p. La substancia inhibidora puede ser algún componente del medio de cultivo o algún producto formado por los microorganismos. El tipo de inhibición, al igual que en cinética enzimática, puede ser competitiva o no competitiva. Para el primer caso:
siendo I la concentración de inhibidor. El valor de K I está inversamente relacionado con la afinidad del microorganismo por el inhibidor. En la inhibición competitiva, se modifica en valor de Ks . Puesto que a > 1 si existe inhibidor (ecuación (22)), resulta que la afinidad del microorganismo por el sustrato se ve disminuída. En la inhibición no competitiva, es el valor de mm el que resulta afectado. En ocasiones algún componente del medio de cultivo puede ser inhibidor del crecimiento, sobre todo cuando se encuentra en concentraciones relativamente elevadas. Esto es factible que ocurra con la fuente de carbono y energía por ser el componente que se encuentra en mayor proporción en los medios. Suele emplearse la siguiente expresión para considerar éste efecto:
El hecho de que una concentración de sutrato elevada pueda inhibir el crecimiento, impone una restricción a la concentración de los medios de cultivo que se pueden emplear en la práctica, y con esto a la concentración final de biomasa que se puede obtener. En el capítulo 7 se verá cómo, empleando un sistema de cultivo adecuado, es posible sortear esta dificultad.
Si reordenamos la ecuación (1) y derivamos respecto del tiempo se obtiene:
o bien:
Introduciendo la ecuación (18) en la (25):
También puede expresarse la velocidad de consumo de sustrato como:
donde qs es la velocidad específica de consumo de sustrato. Comparando las ecuaciones (26) y (27) surge que
Si m=mm se tendrá qs=qsm es decir que ambos parámetros están directamente relacionados. Por lo expuesto hasta aquí es evidente que el crecimiento puede ser caracterizado mediante tres parámetros: KS , mm e Yx/s. Estos dependen tanto del microorganismo como del medio de cultivo empleado, por lo que su evaluación debe realizarse para cada caso en particular.
La ecuación (25) establece que el consumo de sustrato sólo es posible cuando hay crecimiento, sin embargo cuando el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía, puede darse el caso en que el crecimiento es nulo (r x = 0) y el consumo de sustrato no. A este consumo de sustrato que no redunda en aumento de biomasa se lo asocia con el mantenimiento de funciones vitales tales como recambio de material celular, mantenimiento de gradientes de concentración y movilidad. Pirt ha propuesto la siguiente ecuación para la velocidad de consumo de la fuente de carbono y energía:
donde ms es el coeficiente de mantenimiento e Y'x/s es el rendimiento que se obtendría si el mantenimiento fuese nulo. El valor de Y x/s es, oviamente, inferior al de Y'x/s, la relación entre ambos se obtiene dividiendo la ecuación (29) por r x, e introduciendo las ecuaciones (25) y (18).
De la ecuación (30) surge
claramente que cuando Debe destacarse que Yx/s es el rendimiento observable, mientras que Y' x/s sólo puede ser evaluado indirectamente mediante la ecuación (30), aspecto que se discutirá en el capítulo 7. Valores de ms de 0.01 a 0.04 gg h-1 son frecuentes de hallar, pero se incrementan con la temperatura y con la presión osmótica del medio de cultivo. Por ejemplo para Saccharomyces cerevisiae creciendo en anaerobiosis se encuentra un valor de m 8=0.036 gg h-1 , mientras que es diez veces superior si el medio contiene una concentración de NaCl 1 M, lo cual da cuenta del trabajo osmótico que deben realizar las células. De este modo el mantenimiento celular posee una implicancia tecnológica directa, ya que un proceso destinado a la producción de biomasa debe conducirse de modo tal que el valor de ms sea pequeño.
En los microorganismos aerobios la obtención de energía está ligada a la presencia de oxígeno. En efecto, éste es aceptor final de los electrones provenientes de la cadena de citocromos donde se genera abundante ATP (adenosina trifosfato). Las moléculas de ATP aportarán luego la energía necesaria para las reacciones de síntesis con las que el organismo se "fabricará" a sí mismo, y la requerida para el mantenimiento celular. Por analogía con la ecuación (29) se puede expresar la velocidad de consumo de oxígeno (r o2) como:
donde mo es el coeficiente de mantenimiento en base al O2 e Y'x/o es el rendimiento, en base al O2 consumido, que se obtendría cuando mo = 0. Dividiendo ambos miembros de la ecuación anterior por x, se obtiene:
donde qo2 es la velocidad específica de consumo de O2 . En un cultivo en medio líquido los microorganismos utilizan substancialmente el O2 que está disuelto, y el valor de qo2 depende de cual sea esta concentración. Por analogía con la ecuación de Monod, y cuando el O2 es el sustrato limitante, se suele representar esta dependencia como:
donde C es la concentración de O2 disuelto, Ko es la constante de saturación y qo2m es la velocidad específica máxima de consumo de O2 , la cual se obtiene cuando C » Ko. En la práctica se utiliza principalmente el concepto de concentración crítica de oxígeno disuelto, Cc, entendiéndose por tal al valor por encima del cual qo2 es independiente de la concentración de O2 disuelto y por lo tanto el crecimiento no está limitado por oxígeno. En estas condiciones el valor qo2 depende de cuál sea el valor se p, el cual será función del sustrato que limita el crecimiento. Si la concentración de este es saturante, será m=mm, y qo2=qo2m Los valores de Cc para la mayoría de los organismos están en el orden de 0.1 a 1 mg l -1, valores relativamente bajos si se compara con el de la solubilidad del 02, que a 30 °C y 0.21 atmósferas en medios acuosos diluídos es de 7.8 mg l -1 . Esto podría conducir al error de suponer que no constituye un problema satisfacer los requerimientos de O2 en los cultivos, pero el siguiente ejemplo demostrará todo lo contrario. Supongamos que tenemos una concentración celular de 10 g l -1 creciendo activamente en un medio de cultivo con un valor de p = 0.15 h -1 . Suponiendo que mo = 2.6 mg g -1 h-1 , Yx/o=1 g g-1 y que inicialmente es C = 7.8 mg l-1, calcular el tiempo transcurrido hasta que la concentración de O2 se hace crítica e igual a 0.5 mg l-1 . La velocidad de crecimiento será (ec. 18)
Por tanto en escasos 17 segundos el crecimiento comenzará a estar limitado por O2, y eventualmente llegará a detenerse cuando la concentración sea nula, a menos que sea repuesto continuamente y a una velocidad comparable a la de consumo. Este aspecto es fundamental en el diseño de biorreactores destinados a cultivos aerobios, ya que deberán ser capaces de suministrar O2 a altas velocidades a fin de satisfacer la demanda. Efecto del pH y la temperatura sobre el crecimiento
Los microorganismos pueden crecer en una variada gama de pH que va desde pH = 2 para los acidófilos hasta pH = 11 para alcalófilos. En general los microorganismos que toleran pH ácidos no toleran pH alcalinos y viceversa. Independientemente del pH que pueda soportar un microorganismo, es importante conocer cuál es el pH óptimo para el crecimiento. En la fig. 11 está representada en forma general la variación de um con el pH para hongos y bacterias. De la misma surge claramente que en general los hongos tienen un pH óptimo cercano a 5 mientras que para bacterias se da alrededor de pH = 7; además debido a la forma "achatada" de las curvas, variaciones de 0.5 unidades de pH alrededor del óptimo no tienen mayor influencia. Durante el crecimiento los microorganismos modifican el pH del medio de cultivo, normalmente haciéndolo disminuir; por tal motivo es frecuente incluir en el medio substancias que actúen como tampon (buffer) a fin de evitar que el pH se aleje del óptimo. El efecto de la temperatura sobre el crecimiento es complejo. Por un lado cada reacción química individual, de todas las que conforman el metabolismo, es afectada por la temperatura, por lo que un incremento de ésta resulta en una mayor velocidad de reacción. Esto se traduce en un aumento de pm con la temperatura (ver Fig. 12).
Por otra parte, aumentos posteriores de temperatura inactivan las enzimas que catalizan las reacciones, con lo que el valor de um decrece rápidamente. La temperatura óptima resulta de la interacción de estos dos efectos. Como regla general, los microorganismos psicrofilos poseen temperatura óptima entre 10 y 20 °C, los mesófilos entre 30 y 40 °C y, finalmente, los termófilos entre 50 y 60 °C. La necesidad de mantener la temperatura de cultivo en el valor óptimo, hace que los biorreactores (fermentadores) cuenten con dispositivos apropiados para tal fin.
1. Energetics and kinetics in Biotechnology. J.A.Roels. Elsevier Biomedical Press, 1983. 2. Fermentation kinetics and modeling. C.G. Sinclair and B. Kristiansen Ed.: J.D. Bu'Lock. Open University Press, 1987. 3. Principles of Microbe and Cell Cultivation. S.J.Pirt. Blackwel l Scientific Publications, 1975. |
representan
la fracción de energía (de la fuente de carbono y energía) transferida
a la biomasa, al producto y al oxígeno respectivamente. Puesto que por
cada mol de electrones transferidos al O2 se liberan qo
= 27.5 k cal, el calor producido
estará dado por:
