Capítulo 7
Sistemas de cultivo y aspectos generales de biorreactores | Sistemas de cultivo | Batch alimentado | Batch | Cultivo continuo | Determinación de los parámetros de crecimiento | Parámetros de Batch alimentado | Parámetros de Batch | Biorreactores | Lecturas recomendadas |
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SISTEMAS DE CULTIVO Y ASPECTOS GENERALES DE BIORREACTORES
Como ya se dijo, el equipo donde se realiza el proceso se denomina biorreactor o fermentador. El mismo provee todos los servicios que son necesarios para el cultivo, tales como mezclado, termostatización, suministro de oxígeno, entradas para adición de nutrientes, control del pH, etc. Por otra parte, cuando se habla de sistemas de cultivo o, también, métodos de cultivo, se hace referencia al modo de operar el biorreactor, esto es en forma continua o discontinua. En la primer parte de este capítulo estudiaremos los sistemas de cultivo y dejaremos para la segunda los biorreactores. Sistemas de cultivo
Para un componente cualquiera del cultivo, incluida la biomasa, se puede plantear el siguiente balance de materia en el biorreactor (ver Fig. 15).
donde V es el volumen de cultivo, F1 es caudal de alimentación, F2 el de salida, Ci1 la concentración del componente "i" en la alimentación y Ci la concentración en el caudal de salida, la que, si el cultivo esta bien mezclado, se puede asumir idéntica a la que hay dentro del biorreactor. Los restantes términos, rfi y rci se refieren a la velocidad de formación y consumo del componente "i" respectivamente.
Por otra parte el volumen de cultivo variará en el tiempo según sean F1 y F2 . Suponiendo que la densidad del cultivo y de la alimentación son iguales resulta:
Ahora bien, dependiendo de como sean F1 y F2 surgen, básicamente, tres sistemas de cultivo:
El caudal de salida, F 2 , es nulo, por lo que V aumentará en el tiempo en función del caudal de entrada.
y en el balance de materia se anula el término F2 Ci resultando:
Debe destacarse que en este caso V permanece dentro del operador diferencial pues varia con el tiempo según la ec. (4). Por tal motivo el batch alimentado, y a diferencia del caso anterior, tiene duración limitada en el tiempo ya que el volumen no puede incrementarse más allá del volumen útil que posee el biorreactor. 3. Batch
Ambos caudales son nulos por lo que V es constante y en la ec. (1) se anulan los términos Fl Ci1, F2 Ci.
La duración del cultivo batch es, por supuesto, también limitada en el tiempo y depende esencialmente de las condiciones iniciales del cultivo. Una vez inoculado el medio, la concentración de biomasa aumenta a expensas de los nutrientes y cuando el sustrato que limita el crecimiento se agota, finaliza el batch. Analizaremos ahora con más detalle cada uno de los sistemas vistos aplicando en particular los balances de materia a la biomasa, X, al producto, P, y al sustrato limitante de crecimiento, S. Para los dos primeros sólo es necesario considerar la cinética de formación rX y rp respectivamente, con lo cual rci = 0 en ambos casos. Para el sustrato se tiene el caso inverso y sólo deberá considerarse la velocidad de consumo, rs. Si por las características del proceso, la lisis celular o la descomposición del producto son importantes, deberá incluirse en el balance un término adicional que contemple este aspecto. Cultivo continuo
Para poner en marcha un cultivo continuo, se realiza previamente un cultivo batch y en un momento dado se comienza a alimentar con medio fresco a un caudal F y por un rebalse se mantiene el volumen constante. El caudal de salida contendrá células, medio de cultivo parcialmente agotado y, eventualmente, algún producto. Si alimentamos con medio fresco significa que X1 = 0 y P1 = 0, por lo que sólo deberemos considerar la concentración de sustrato limitante del crecimiento, S1, en la alimentación. En base a estas consideraciones los balances de materia para X, S y P serán (ver ec. (3)):
En estado estacionario las concentraciones dentro del biorreactor permanecerán constantes en el tiempo, lo que significa igualar a cero las ecuaciones (7), (8) y (9). De la primera, y teniendo en cuenta que rX = mx, resulta:
donde D es la velocidad de dilución. Si se reemplaza m por la ec. (19) del capítulo 5 resulta que la concentración de S en estado estacionario es
donde S representa la concentración en estado estacionario. De la ec. (8) surge:
Por la ecuación (26) del capítulo 5 es
además m = D, por lo tanto la concentración de biomasa en estado estacionario es:
Si en particular S es la fuente de carbono y energía, rs vendrá dado por la ecuación (29) del capítulo 5 y X será:
Cuando ms = 0, la ecuación (14) se reduce a la ecuación (13).
La Fig. 16 muestra como varían la concentración de sustrato en estado estacionario en función de la velocidad de dilución. La curva superior corresponde a la ecuación (13) y la inferior a la ecuación (14), pudiéndose observar en este último caso que el efecto del mantenimiento celular se hace notable a bajas velocidades de dilución. En ambos casos puede apreciarse que existe un valor de D por encima del cual es X = 0, con lo cual por la ecuación (13) o (14) es S = S1. Si se reemplaza este valor en la ecuación (11) se obtiene la velocidad de dilución crítica Dc.
Si como ocurre normalmente S1 » Ks se tiene que Dc = mm, lo cual es un criterio muy útil en el momento de seleccionar un valor de D apropiado, ya que deberá cumplirse que D <mm. En caso contrario ocurrirá el "lavado" del cultivo, debido a que la velocidad de salida de las células del biorreactor será mayor que la de crecimiento. Debe tenerse en cuenta que la Fig. 16 se representa en caso que pl está dado por la ecuación de Monod, pero si en medio del cultivo hay sustancias inhibidoras del crecimiento (o son formados por microorganismos) o el sustrato limitante es el inhibidor, deberán emplearse las expresiones de m correspondientes dadas en el capítulo 5. Formación de producto: En estado estacionario, la ecuación (9) se reduce a:
o bien
donde P representa la concentración de producto en estado estacionario. Dependiendo de como sea la cinética de formación del producto será la forma de la curva P vs. D. Alternativamente puede emplearse, y de hecho se emplea, el cultivo continuo para elucidar qué tipo de relación existe entre qp y m, ya que como se mencionó en el capítulo 6, es uno de los factores a tener en cuenta para planear la estrategia de producción, como se verá más adelante cuando se trate la producción de penicilina. Determinación de los parámetros de crecimiento:
El cultivo continuo es sumamente útil para determinar parámetros de crecimiento tales como Ks, mm o Y'x/s. Así reordenando la ecuación (11) se obtiene
de donde la gráfica de D (S1-S) /X en función de D permitirá estimar 1/Y'x/s y ms. Obviamente en este caso el sustrato considerado es la fuente de carbono y energía.
Para iniciar un batch alimentado valen las mismas consideraciones que se hicieron para iniciar un cultivo continuo, salvo que en este caso supondremos que se inicia la alimentación del cultivo cuando el sustrato limitante se ha agotado. Si bien éste no es un requisito indispensable, permite simplificar el tratamiento matemático y además es un buen punto de partida con respecto al objetivo del batch alimentado, es decir: controlar la velocidad de crecimiento mediante la velocidad de alimentación. También supondremos que alimentamos con medio de cultivo fresco, es decir que Xl = 0 y Pl = 0. Luego los balances de materia para X, S y P serán (ec. (5)):
A fin de no extender innecesariamente el tratamiento matemático discutiremos solamente la formación de biomasa y el consumo de sustrato. De todos modos, si rp es conocida el procedimiento no varía mayormente. Si en la ecuación (21) se reemplaza rs por rx / Yx/s y se tiene en cuenta la ecuación (20) resulta
Si deseamos que la velocidad de crecimiento esté controlada por la de alimentación, ésta deberá ser tal que en todo momento sea S =0 y por lo tanto d(SV) / dt = 0. Esto equivale a decir que el sustrato es consumido totalmente ni bien ingresa al biorreactor. Luego:
donde Xo y Vo representan la concentración de biomasa y el volumen de cultivo en el momento de iniciar la alimentación. La variación de V con el tiempo se obtiene integrando la ec. (4).
El criterio para diseñar una alimentación adecuada se obtiene combinando las ecuaciones (20) y (24), de donde at = 0, resulta
En la ec. (27) se puede emplear cualquier valor de m hasta mm, por tanto la ec. (27) puede reescribirse como:
Como criterio adicional conviene seleccionar el valor de S1 tan alto como sea posible y F relativamente pequeño a fin de evitar la excesiva dilución del cultivo. La contrapartida es que la duración del batch alimentado puede prolongarse excesivamente, por lo que normalmente se trata de encontrar la solución de compromiso, donde intervienen además, aspectos económicos. El valor de m durante el batch varía permanentemente, ya que por la ecuación (20) es:
reemplazando en la ecuación (29) las ecuaciones (24) y (25) resulta
Por tanto m disminuye con el tiempo. Esto es válido solamente para el caso tratado aquí, es decir con F y S 1 constantes, pero nada impide hacer alimentaciones con F = F(t) o S1 = S1 (t), con lo cual puede lograrse, por ejemplo, que m se mantenga constante o bien que aumente hasta valores cercanos a mm La diversidad de alimentaciones posibles que pueden emplearse es, quizás, una de las características más apreciables de batch alimentado. La otra es que este sistema de cultivo es muy apropiado para obtener altas concentraciones de biomasa, muy superiores a las que se podrían obtener en un batch, donde la limitación está dada por la concentración inicial de nutrientes del medio de cultivo que pueden tolerar los microorganismos. Si se considera el mantenimiento celular el valor de rs para la fuente de carbono y energía vendrá dado por la ecuación (29) del capítulo 5, y mediante un proceso similar al descripto resulta:
Este valor se obtiene directamente de la ecuación (31) haciendo d (XV) / dt = 0. En estas condiciones la totalidad de la fuente de carbono y energía que ingresa
Suponiendo que no se forma producto y que la relación m-S puede ser representada por la ecuación de Monod surge que:
El sistema formado por las ecuaciones (38) y (39) posee solución analítica, pero en ésta no aparece X en forma explícita por lo que resulta de escasa utilidad. En cambio es posible analizar casos particulares haciendo algunas suposiciones. Por ejemplo se puede asumir que durante una buena parte del tiempo se cumplirá que S » Ks, por lo tanto las ecuaciones (38) y (39) se reducen a:
Por tanto bajo las condiciones indicadas el crecimiento se llevará a cabo con el máximo valor de p posible. Integrando la ecuación (40) con la condición a t = 0; X = Xo, se llega a la expresión:
o bien:
La ecuación (42) establece que para S » Ks el crecimiento es exponencial (fase exponencial), y por la ecuación (43) es posible calcular el valor de mm graficando el lnX en función del tiempo. La variación de S con t se obtiene introduciendo la ecuación (42) en la ecuación (41) e integrando con la condición:
A medida que el cultivo transcurre, S disminuye hasta que se llega a la condición en que S es comparable a Ks y por lo tanto dX/dt comienza a disminuir (fase de desaceleración) hasta hacerse finalmente nula cuando S = 0. En este punto se alcanza la máxima concentración de biomasa y finaliza el batch (fase estacionaria). La concentración final de biomasa, Xf se puede calcular si se conoce el Yx/s:
puesto que Sf = 0 resulta:
Alternativamente se pueden emplear las ecuaciones (45) o (46) para calcular el Yx/s. En la Fig. 18 se representan las distintas fases de crecimiento hasta aquí descriptas, que surgen de suponer válida a la ecuación de Monod. Sin embargo antes de la fase exponencial suele existir otra fase (I) conocida como fase de retardo, durante la cual la concentración de biomasa no se modifica substancialmente, pero ocurren profundos cambios en la composición macromolecular y en el "estado fisiológico" de las células, ambos tendientes a adaptarlas al nuevo entorno. Si se considera esta fase, debe aplicarse una corrección a la ecuación (43), lo que esencialmente consiste en restarle al tiempo real el tiempo transcurrido hasta que efectivamente comienza el crecimiento
donde tr da cuenta de la duración de la fase de retardo. Normalmente esta fase no es deseable ya que significa una pérdida de tiempo, por lo que usualmente se trata de minimizarla. Una forma de lograrlo consiste en hacer crecer el inóculo en un medio de cultivo igual al que se va a emplear posteriormente, y además transferirlo cuando las células se encuentran en plena fase exponencial. Por otra parte después de la fase estacionaria sobreviene la fase de declinación (V) que consiste en una disminución de la concentración de biomasa debida a la lisis celular. Esta fase puede representarse considerando una cinética adicional en el balance de materia, aspecto que ya fue discutido.
El cultivo tipo "batch", si bien es quizás el más difundido, es el que menos posibilidades de control ofrece. Una vez sembrado el medio de cultivo y fijada la temperatura, las células quedan "libradas a su propia suerte" o, dicho de otro modo, a su propia potencialidad, que se manifiesta creciendo a la máxima velocidad que le permite el medio de cultivo empleado, siendo el operador un mero espectador de los acontecimientos. En este aspecto tanto el cultivo continuo como el "batch" alimentado superan ampliamente al "batch".
El biorreactor, es sin duda, uno de los equipos fundamentales de la microbiología industrial. Es el recipiente donde se realiza el cultivo, y su diseño debe ser tal que asegure un ambiente uniforme y adecuado para los microorganismos. Las "tareas" que realiza el biorreactor pueden resumirse del siguiente modo:
Para satisfacer los cuatro primeros puntos es necesario que el biorreactor esté provisto de un sistema de agitación, a demás para el punto d) se requiere de un sistema que inyecte aire en el cultivo. Describiremos brevemente dos tipos de biorreactores de uso muy difundido: el tanque agitado y al "air lift". En el primero de ellos (Figura 19) la agitación se realiza mecánicamente mediante un eje provisto de turbinas accionado por un motor.
Para tanques mayores que 1000 ó 2000 litros este sistema ya no es eficiente y es reemplazado por un serpentín que circula adyacente a la pared interior del tanque. Debe tenerse en cuenta que a medida que es mayor el volumen de cultivo también lo es la cantidad de calor generado (capítulo 5), por lo que se hace necesario una mayor área de refrigeración. Los tanques son de acero inoxidable y están pulidosa fin de facilitar la limpieza y posterior esterilización. El aire que ingresa al biorreactor debe estar estéril, lo que se consigue haciéndolo pasar por un filtro cuyo diámetro de poro es de 0,45 micrones, que impide el paso de mircroorganismos y esporos. En los reactores de tipo "air lift" (Figura 20) es el mismo aire inyectado al cultivo lo que promueve la agitación. Básicamente consiste en dos cilindros concéntricos y por la base de uno de ellos, por ejemplo el interior, se inyecta aire. De este modo se genera una circulación de líquido ascendente en el compartimento interno y descendiente en el externo, lo que favorece el mezclado. Transferencia de 02 La velocidad de transferencia de 02 , R02, desde el seno de la fase gaseosa (burbujas) hasta la fase líquida está dada por la siguiente ecuación:
donde KLa es el coeficiente volumétrico de transferencia de oxígeno, C la concentración de 02 disuelto en el seno del líquido y C* la concentración de O2 disuelto que. estaría en equilibrio con la presión parcial de oxígeno de la fase gaseosa. El KLa depende del diseño del biorreactor, de las condiciones de operación (caudal de aire, agitación) y de la viscosidad del cultivo. A mayor viscosidad menor KLa. El KLaes una medida de la capacidad que posee un biorreactor para sumínistrar 02 y el rango de valores usuales está comprendido entre 50 h-1 y 1000 h. Es útil en este punto retomar el ejemplo visto al final del capítulo 5 y calcular el KLa necesario para que la velocidad de transferencia de 02 sea igual a la de consumo; esto significa que R02 deberá ser igual a 1,526 mg l-1 h-1. Asumiendo que C* = 7,8 mg l -1 y C = 0,5 mg l -1 , resulta
P or tanto valores de KLa iguales o superiores al calculado asegurarán, para el ejemplo visto, que el cultivo no está limitado por O2 . Cuando la velocidad de consumo del oxígeno varía con el tiempo, como ocurre por ejemplo en un cultivo "batch", el cálculo de KLa necesario se realiza empleando el máximo valor de rO2 esperado, a fin de asegurar un adecuado suministro de O2 durante todo el cultivo.Con este capítulo finaliza el tratamiento de los aspectos fundamentales de los procesos de fermentación. Resta tratar las aplicaciones de la Microbiología Industrial y las posibilidades que pueden presentarse en el futuro. Como ejemplo de esas aplicaciones se incluyen en esta monografía los procesos correspondientes a la producción de levadura de panificación, penicilina y otro correspondiente al tratamiento de efluentes. La producción de levadura es un proceso clásico de las primeras etapas del desarrollo de la Microbiología Industrial, mientras que el de penicilina representa un cambio fundamental en la evolución de nuestra disciplina, a partir de 1945. En ambos procesos se demuestra la integración de varios de los aspectos básicos tratados con anterioridad. Finalmente la elección del tema de tratamiento de efluentes industriales responde a la trascendencia cada vez más importante que tiene el problema de la contaminación ambiental y a las soluciones que ofrece la Microbiología Industrial para encararlo.
1. Principles of microbe and cell cultivation. S.J.Pirt. Blackwel l Scientific Publications (1975) 2. Fermentation kinetics and modelling. C.G.Sinclair and B. Kristiansen. Ed. J.D. Bu'Lock. Open University Press (1987). 3. Biochemical Engineering Fundamentals. J.E. Bailey and D.F. Ollis. Mc Graw-Hill Book Company (1986). 4. Biochemical Engineering. S. Aiba, A.E. Humprey and N.F. Millis. Academic Press, 1973. |
