HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE LA BIOLOGÍA

Principios de Microscopía

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El uso de la Histología en los sistemas de Cultivo in Vitro de tejidos (*.pdf)
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Microscopía Electrónica de Barrido 
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Conocer los equipamientos para la observación celular


Tamaño celular

Las células son las unidades básicas de los seres vivos. La mayoría de ellas son de pequeño tamaño por lo que es indispensable el uso de instrumentos como los microscopios para su visualización. Por lo general el poder resolutivo del ojo humano es de 0.2mm (200 µm), o sea la menor distancia vista o resuelta por el ojo humano es de dos líneas separadas 1mm de distancia; si hay dos líneas a 200 µm de distancia, veremos una sola línea. Los microscopios se utilizan para mejorar la resolución.

La invención del microscopio en el siglo XVII posibilitó la serie de descubrimientos posteriores de las mismas. En 1665 Robert Hooke utilizando un microscopio óptico simple, examinó un corte de corteza, encontró que esta estaba compuesta por una masa de diminutas cámaras, que llamó  “células”, en realidad sólo vió las paredes celulares, ya que este tejido está muerto a la madurez y las células ya no tienen contenido.  Mas tarde, Hoock y algunos de sus contemporáneos observaron células vivas.

imagen de http://www.biologia.arizona.edu/

Existen dos tipos básicos de microscopios: ÓPTICOS y ELECTRÓNICOS.

Microscopio óptico (MO)

El tipo de microscopio más utilizado es el microscopio óptico, que se sirve de la luz visible para crear una imagen aumentada del objeto. El microscopio óptico más simple es la lente convexa doble con una distancia focal corta. Estas lentes pueden aumentar un objeto hasta 15 veces. Por lo general se utilizan microscopios compuestos, que disponen de varias lentes con las que se consiguen aumentos mayores. Algunos microscopios ópticos pueden aumentar un objeto por encima de las 2.000 veces.

El microscopio compuesto consiste en dos sistemas de lentes, el objetivo y el ocular, montados en extremos opuestos de un tubo cerrado. El objetivo está compuesto de varias lentes que crean una imagen real aumentada del objeto examinado. Las lentes de los microscopios están dispuestas de forma que el objetivo se encuentre en el punto focal del ocular. Cuando se mira a través del ocular se ve una imagen virtual aumentada de la imagen real. El aumento total del microscopio depende de las longitudes focales de los dos sistemas de lentes.

El equipamiento adicional de un microscopio consta de un armazón con un soporte que sostiene el material examinado y de un mecanismo que permite acercar y alejar el tubo para enfocar la muestra. Los especimenes o muestras que se examinan con un microscopio son transparentes y se observan con una luz que los atraviesa, y se suelen colocar sobre un rectángulo fino de vidrio. El soporte tiene un orificio por el que pasa la luz. Bajo el soporte se encuentra un espejo que refleja la luz para que atraviese el espécimen. El microscopio puede contar con una fuente de luz eléctrica que dirige la luz a través de la muestra.

Los MO actuales tiene un poder resolutivo de 0,2 µm, unas mil veces la del ojo humano. 

Existen distintas variantes de observación en MO:

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Microscopía óptica normal (de campo brillante coloreado): El material a observar se colorea con colorantes específicos que aumentan el contraste y revelan detalles que no aprecian de otra manera

Célula de Pisum
coloración: safranina-fast-green
Traqueidas del leño de Pinus
Coloración: safranina
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Microscopía de campo brillante: el material se observa sin coloración. La luz pasa directamente y se aprecian detalles que estén naturalmente coloreados.

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El microscopio en campo oscuro utiliza una luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espécimen. El campo de visión del objetivo se encuentra en la zona hueca del cono de luz y sólo recoge la luz que se refleja en el objeto. Por ello las porciones claras del espécimen aparecen como un fondo oscuro y los objetos minúsculos que se están analizando aparecen como una luz brillante sobre el fondo. Esta forma de iluminación se utiliza para analizar elementos biológicos transparentes y sin manchas, invisibles con iluminación normal.

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Microscopía en contraste de fase: se usa principalmente para aumentar el contraste entre las partes claras y oscuras de las células sin colorear. Es ideal para espécimenes delgados, o células aisladas. El microscopio de fase ilumina el espécimen con un cono hueco de luz, como en el microscopio en campo oscuro. Sin embargo en el microscopio de fase el cono de luz es más estrecho y entra en el campo de visión del objetivo, que contiene un dispositivo en forma de anillo que reduce la intensidad de la luz y provoca un cambio de fase de un cuarto de la longitud de onda. Este tipo de iluminación provoca variaciones minúsculas en el índice de refracción de un espécimen transparente, haciéndolo visible. Este tipo de microscopio es muy útil a la hora de examinar tejidos vivos, por lo que se utiliza con frecuencia en biología y medicina
Phase contrast image of cultured epithelial cells using a 20X objective.

20X Phase-Contrast Image

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Nomarski, microscopía diferencial de contraste de interferencia (DIC). Utiliza dos rayos de luz polarizada y las imágenes combinadas aparecen como si la célula estuviera proyectando sombras hacia un lado. Fue diseñado para observar relieves de especimenes muy difíciles de manejar, es muy utilizado en los tratamientos de fertilización in-vitro actuales. DIC se usa cuando el espécimen es muy grueso para usar contraste de fases

Células epiteliales 200X

20X DIC Image
www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/20x_dic.tif

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Microscopía de fluorescencia: una sustancia natural en las células o un colorante fluorescente aplicado al corte es estimulado por un haz de luz, emitiendo parte de la energía absorbida como rayas luminosos: esto se conoce como fluorescencia. La luz fluorescente de mayor longitud de onda se observa como si viniera directamente del colorante. 

Células epiteliales , triple coloración: núcleo (azul), microtubulos (verdes), actina (rejo). 200X (izq.) y 1000X  (der.).
20X Fluorescent Image 100X Fluorescent Image
www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/microscopy/images/100x_fluor.tif 
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Microscopía confocal.


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Microscopía confocal y de fluorescencia http://www.itg.uiuc.edu/technology/atlas/ 

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Página de la casa Leica, sobre fundamentos de este microscopio y modelos http://www.leica-microsystems.com/llt_index.html 

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Curiosas microfotografías con microscopía de barrido y posibilidad de manejar virtualmente uno de estos microscopios http://www.denniskunkel.com/ 

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Completa colección de técnicas de tinción, con sus correspondientes protocolos http://www.nottingham.ac.uk/pathology/default.html 

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Página de introducción al funcionamiento del microscopio confocal, preparación de muestras y procesado de las imágenes http://www.cs.ubc.ca/spider/ladic/intro.html 

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Manual de técnicas de preparación de muestras y tinción http://bris.ac.uk/pathandmicro/cpl/lablinks.html 

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Fundamentos de la microscopía de resonancia magnética y completa galería de imágenes animadas http://wwwcivm.mc.duke.edu/civmGallery/L1Gallery.html 

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Una de las mejores páginas sobre microscopía, con amplios textos sobre los diversos tipos de microscopios y su funcionamiento. Numerosos tutoriales en java sobre el manejo de distintos microscopios. Se puede descargar un completo manual sobre microscopía en formato Acrobat. http://micro.magnet.fsu.edu/primer/index.html 

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Descripción y funcionamiento del microscopio electrónico de barrido y galería de imágenes http://www.mos.org/sln/sem/ 

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Fundamentos del microscopio electrónico de barrido, descripción del funcionamiento con numerosos esquemas. Galería de imágenes http://www.mse.iastate.edu/microscopy/home.html 

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Completo tratado sobre microscopía electrónica: fundamentos, microscopios, preparación de muestras y procesado digital de las imágenes http://em-outreach.sdsc.edu/web-course/toc.html 

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Fundamentos teóricos de microscopía óptica, fluorescencia y confocal http://www.btrip.mednet.ucla.edu/bri/homepage.htm

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Descripción y fundamento de los microscopios electrónicos de transmisión y barrido http://www.unl.edu/CMRAcfem/em.htm 

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Completo tutorial de digitalización de imágenes, donde se explican los términos básicos http://www.library.cornell.edu/preservation/tutorial-spanish/contents.html 


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Métodos de microscopía electrónica de barrido en Biología. José Ojeda Sahagún. Univ. de Cantabria. 1997.

 

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Universidad Nacional del Nordeste •  • Fac. Ciencias Agrarias, Corrientes • 

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