HIPERTEXTOS DEL ÁREA DE LA BIOLOGÍA
PRINCIPAL INTRODUCCIÓN ANIMACIONES CÉLULAS BIODIVERSIDAD HERENCIA EVOLUCIÓN

DISCUSION


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Los estudios realizados en Bufo arenarum indican que las variaciones estacionales afectan a los componentes neuroendocrinos que regulan diferentes parámetros de la actividad gonadal, particularmente la maduración del ovocito proceso indispensable para asegurar el éxito de la fecundación y el desarrollo de un nuevo individuo.

CONTROL DE LA MADURACION CITOPLASMATICA

1- Factores inhibidores

En la mayoría de los vertebrados es conocido el efecto inhibitorio que la glándula pineal ejerce sobre el eje hipotálamo-hipófisis-gónada (Pang y col.,1998), responsable de la regulación de la actividad reproductora (Whittier y Crews, 1987).

Sin embargo en anfibios, hasta el momento, los datos sobre la influencia de la pineal sobre este eje están limitados a la determinación de receptores para la melatonina a nivel de estructuras cerebrales de algunas especies (Tavolaro y col., 1995; Mazzucchelli y col., 1996). Respecto a la interacción pineal-ovario, los estudios realizados son escasos y sólo aportan resultados contradictorios en lo concerniente a la importancia funcional de dicha interacción (Alonso-Bedate y col., 1990).

Los datos obtenidos en el presente trabajo muestran que la pineal así como su principal hormona, la melatonina, modifican la actividad metabólica en el ovario determinando un incremento en la capacidad oxidativa de citrato y fumarato, expresada como índice C/F. De esta manera los ovocitos ováricos de Bufo arenarum adquieren el comportamiento metabólico del período de reposo sexual de la especie (Legname y Salomón de Legname, 1980), que caracteriza a los ovocitos citoplasmáticamente inmaduros (Legname y Bühler, 1978).

En concordancia con nuestros resultados, estudios realizados en ratas por Díaz López y Marín Fernández (1984) permitieron determinar cambios metabólicos a nivel ovárico. Estos autores demuestran que el consumo de oxígeno varía durante el ciclo sexual, obteniéndose los mayores valores durante la fase de estro (período reproductor). Por acción de la melatonina ovarios en el período de estro modifican su metabolismo oxidativo, adquiriendo características propias del diestro (período de reposo sexual).

Aun cuando en Bufo arenarum el aumento de la actividad metabólica producido por la melatonina se observa en los dos períodos estacionales en estudio, la magnitud y el perfil de la respuesta a la hormona varían según la etapa del ciclo reproductor. Un significativo incremento de la capacidad oxidativa se observa durante el otoño y comienzos del invierno que corresponde a la fase inicial del período de reposo, con marcada disminución e incluso ausencia de este efecto en la fase final de dicho período y posterior incremento durante el período reproductor.

Las diferencias estacionales en la respuesta a la melatonina pueden ser atribuidas a variaciones en la actividad de la pineal. Resultados obtenidos en anfibios (D’Istria y col., 1994) y mamíferos (Reiter, 1993; Pang y col., 1998) demuestran mayor funcionalidad de la glándula durante los meses de baja temperatura y poca luminosidad, que corresponde al período de reposo de las especie estudiadas. Esta diferencia se traduce en un incremento de la síntesis de melatonina durante dicho período (Delgado y Vivien – Roels, 1989; D’Istria y col., 1994), y corrobora el rol de neurotransductor de fotoperíodos y temperatura atribuido a la glándula pineal. Asimismo permitiría explicar las menores dosis necesarias para inducir cambios metabólicos en los ovocitos de Bufo arenarum obtenidos en el período de reposo, comparados con los del período reproductor. Por otra parte, no puede descartarse que las variaciones estacionales mencionadas reflejen cambios en la concentración de receptores para la hormona a nivel de la gónada.

Es evidente que estudios posteriores son necesarios a fin de dilucidar no sólo la diferente respuesta observada a lo largo del año, sino también la refractariedad a la acción de la melatonina durante la fase final del período de reposo.

Nuestros resultados muestran por primera vez un efecto directo de la melatonina sobre el gameto. En efecto, luego de la ovulación, los ovocitos celómicos libres de células foliculares obtenidos durante el período reproductor, responden al tratamiento con la glándula o con melatonina con un marcado incremento del índice C/F. Estos datos indican que las células foliculares si bien no interfieren, no son necesarias para que actúe la melatonina y sugieren la presencia de receptores para la hormona en el ovocito. De esta manera se ampliaría el espectro de sitios de unión para la hormona conocidos hasta el momento en el sistema reproductor.

Un aspecto a destacar es la adquisición de mayor sensibilidad de los ovocitos a la melatonina luego de ser expuestos a la acción de la hipófisis. Experimentos realizados en un mismo animal indican que los ovocitos ováricos y celómicos obtenidos después del tratamiento hipofisario muestran, por efecto de la melatonina, mayor incremento del índice C/F en relación a sus respectivos controles.

Esta evidencia fue confirmada al trabajar con ovocitos ováricos obtenidos en la fase final del período de reposo, que normalmente no responden a la melatonina y sin embargo, luego del pretratamiento con hipófisis adquieren sensibilidad a la hormona. Estos resultados sugieren que la acción previa de las gonadotrofinas hipofisarias mejora la respuesta de los ovocitos a la melatonina. Una posible explicación surge de los datos aportados por Legname y col. (1976) y Budeguer de Atenor y col. (1989), quienes demuestran que el tratamiento de ovocitos con un homogenado de hipófisis o con FSH determina una disminución del índice C/F. De esta manera valores bajos del índice permitirían evidenciar una mayor respuesta a la melatonina. Estas observaciones abren camino a posteriores estudios tendientes a dilucidar la importancia y el rol de la interrelación hipófisis-melatonina en esta especie.

Tanto la glándula pineal como la melatonina tienen la capacidad de inhibir la ovulación "in vitro", dato que concuerda con resultados previos en Xenopus (O’Connor, 1969) y mamíferos (Ying y Greep, 1973). El efecto inhibidor determinado por la glándula fue mayor que el producido por la hormona, probablemente debido a que la pineal contiene no sólo melatonina sino también L-metoxitriptofol (Joy y Agha, 1991; Skene y col., 1991), indol con reconocidos efectos antigonadales. Es importante destacar que la glándula posee también otros metoxindoles (Chan y Ng, 1995) y diferentes neuropéptidos cuyo rol fisiológico se desconoce hasta el presente.

Los resultados del estudio histológico de la pineal de Bufo arenarum demuestran la presencia de dos tipos celulares equivalentes en sus características generales a los pinealocitos con función neurotransductora y a las células gliales con función de sostén, descriptos para otras especies (Hetherington, 1981). A diferencia de lo observado en Triturus marmoratus por Bardasano y col. (1983) cabe destacar que bajo nuestras condiciones experimentales, en Bufo arenarum no se pudo apreciar diferencias en la organización histomorfológica de la glándula de hembras recolectadas durante los períodos de reposo y reproductor.

Este hecho podría atribuirse a que la capacidad secretora de la pineal puede no estar representada por parámetros histomorfológicos de la glándula, sino ser la resultante de un complejo sistema de aferencias nerviosas centrales y periféricas y de señales hormonales que en forma coordinada regulan la tasa de secreción.

Un efecto metabólico similar al observado con la melatonina fue obtenido al incubar ovocitos con noradrenalina. El incremento del índice C/F determinado por esta droga simpaticomimética fue dosis dependiente y se puso de manifiesto tanto en ovocitos ováricos como en ovocitos celómicos libres de células foliculares. Estos datos sugieren la presencia de receptores adrenérgicos en el gameto.

La evidencia de que la noradrenalina es un factor determinante de un comportamiento metabólico característico del período de reposo, está probablemente relacionada con las variaciones estacionales en los niveles de esta catecolamina. En efecto, el contenido de noradrenalina es mayor tanto en las adrenales (Rapela y Gordon, 1956) como en el plasma (Segura y D’Agostino, 1964) de Bufo arenarum durante los meses de otoño-invierno.

La evaluación de nuestros resultados "in vitro" permite concluir que en esta especie tanto la glándula pineal, a través de la acción de la melatonina, como la noradrenalina inducen en forma independiente el tipo de metabolismo oxidativo que caracteriza a los ovocitos citoplasmáticamente inmaduros. Es razonable extrapolar estos datos obtenidos "in vitro" a las condiciones "in vivo" y considerar que el estado de madurez citoplasmática, fisiológicamente, es la resultante de la acción conjunta de ambas hormonas.

Por otra parte no puede descartarse que la noradrenalina podría actuar a dos niveles, por un lado directamente sobre el ovocito y por otro lado sobre la glándula pineal regulando su nivel de actividad. Al respecto en mamíferos se conoce que la NAT, enzima que regula la secreción de melatonina, incrementa su actividad por estimulación simpática. El neurotransmisor involucrado es la noradrenalina la que actuando sobre receptores de tipo b 1, ubicados en el pinealocito, estimula la actividad de la NAT aumentando los niveles de melatonina (Ruzsas y col., 1997).

Coincidentemente Iturriza (1967) demostró la presencia de terminales nerviosas simpáticas en la pineal de Bufo arenarum, sin indicar la función atribuida a esta inervación. Aun cuando se carece de datos posteriores, es factible considerar que "in vivo" la actividad de la glándula pineal de esta especie puede estar sometida a una regulación compleja, de modo que la información fotoperiódica básica pueda ser modulada por señales procedentes del sistema nervioso central.

Hacia fines del período de reposo y como consecuencia de un incremento paulatino de los fotoperíodos disminuye la actividad de la pineal con lo cual desaparece el freno sobre el eje hipotálamo-hipofisario. Esta situación permite el incremento en la liberación de gonadotrofinas y por consiguiente de esteroides ováricos (Fortune, 1983), los que a través de diferentes vías modificarían los niveles de las hormonas y neurotransmisores involucrados en la determinación del comportamiento metabólico de un ovocito citoplasmáticamente inmaduro.

El funcionamiento de esta vía de regulación está respaldado por experimentos que demuestran que el aumento en los niveles de FSH produce depleción del contenido de noradrenalina en folículos de rata (Ben-Jonathan y col., 1982). A su vez, respecto a las hormonas ováricas, se ha demostrado que el incremento en la secreción de estradiol produciría dos efectos: por un lado determina disminución de la síntesis y secreción de melatonina (Okatani y col., 1998), y por otro disminuye la producción de noradrenalina en las áreas del sistema nervioso central encargadas de regular la actividad de las gónadas y el comportamiento reproductor (Osada y Nomura, 1989).

Por lo tanto el efecto conjunto de factores físicos ambientales (incremento de fotoperíodos y temperatura) y factores químicos internos (hormonas) llevarían a una inhibición de la actividad de la pineal y a una disminución en la síntesis de noradrenalina, eventos que favorecerían el inicio del proceso de maduración.

2- Factores estimulantes

Coincidente con la finalización de los meses de baja temperatura e inicio de la primavera se incrementa la actividad hipofisaria en Bufo arenarum (Houssay, 1947). Si bien en los vertebrados inferiores, al igual que en los mamíferos, existe una estrecha relación entre la actividad secretora de la hipófisis y la actividad reproductora (Whittier y Crews, 1987), son escasos los datos acerca de los niveles de gonadotrofinas circulantes durante el ciclo sexual de anfibios anuros. Nuestros datos muestran una significativa diferencia en las concentraciones séricas de gonadotrofinas en los dos períodos del ciclo. Los valores determinados en hembras recolectadas durante el período de reposo son bajos, comparados con los niveles circulantes en hembras capturadas en el período reproductor. Variaciones estacionales similares fueron observadas en Rana nigromaculata por Kim y col. (1998).

Aun cuando los animales fueron capturados en una misma zona y período del año se puede observar, al igual que para otras hormonas, una amplia variación en los niveles determinados dentro de cada grupo analizado. Esta dispersión de datos puede atribuirse al hecho de que los ejemplares, aun tomados de su ambiente natural, suelen presentar heterogeneidad en los patrones de actividad hipofisaria y gonadal. Por otra parte se han descripto importantes variaciones en los niveles hormonales circulantes de anfibios, por estrés de captura (Licht y col., 1983).

En relación al efecto de las gonadotrofinas sobre el ovocito, en mamíferos la FSH es la hormona relacionada con el desarrollo de competencia maduracional y con la modulación de este proceso a nivel citoplasmático (Bar-Ami y col., 1983). Estos datos coinciden con los obtenidos en Bufo arenarum que demuestran que la FSH induce la maduración citoplasmática, ejerciendo su acción a través del sistema adenilato ciclasa-AMPc (Budeguer de Atenor y col., 1989).

De acuerdo a nuestros resultados la adrenalina, al igual que la FSH, modifica el comportamiento metabólico de los ovocitos del período de reposo, determinando una disminución del índice C/F a valores típicos del período reproductor. Este cambio metabólico le confiere a los ovocitos la propiedad de ser considerados citoplasmáticamente maduros (Legname y Bühler, 1978).

En coincidencia con el efecto observado, el contenido de esta catecolamina en plasma de Bufo arenarum muestra variaciones estacionales, con valores bajos en el período de actividad sexual y con un progresivo incremento en el período de reposo. Por otra parte, la acción de la adrenalina fue dosis dependiente siendo más significativa a la concentración de 10-7 M, valor que entra en el rango fisiológico circulante detectado en esta especie en el período de reposo (Segura y D’Agostino, 1964).

Es importante señalar que en todos los vertebrados, a nivel de diferentes órganos de la economía, las terminaciones nerviosas autonómicas representan otra fuente de catecolaminas. Sin embargo, aún cuando existe una amplia descripción de la inervación ovárica en aves (Unsicker y col., 1983; Müller-Marschhausen y col., 1988) y mamíferos (Spicer, 1986; Sporrong y col., 1991), nuestros datos constituyen los primeros aportes referentes a las características de la inervación del ovario de vertebrados inferiores.

Los estudios histológicos y ultraestructurales revelan que en la gónada de la hembra de Bufo arenarum existe una importante red de fibras nerviosas que en su mayoría convergen sobre los vasos sanguíneos o se localizan en la proximidad de las fibras musculares lisas de la corteza ovárica. Esta disposición sugiere un probable control nervioso del flujo sanguíneo, así como de la contractibilidad de la gónada. El análisis de la morfología, el tamaño y las características de las vesículas sinápticas, presentes en las terminales nerviosas, permite inferir que se tratan de terminaciones adrenérgicas. El hecho de no observar terminales colinérgicas en nuestras condiciones experimentales, coincidiría con los resultados que indican que la acetilcolina no modifica el comportamiento metabólico de los ovocitos.

Una evidencia adicional de la posible participación de la adrenalina como mediadora de la acción del sistema nervioso autonómico de los anfibios en la maduración ovocitaria lo constituye el hecho de que, a diferencia de lo que sucede en mamíferos, el principal neurotransmisor simpático es la adrenalina (Falck y col., 1963; Herman y Sandoval, 1983).

Los datos que demuestran que esta catecolamina es activa tanto en los ovocitos ováricos como en los celómicos, indican que en su mecanismo de acción no intervienen las células foliculares. Estos resultados difieren de los obtenidos en estudios realizados en ovocitos de Xenopus laevis los que describen cambios en la conductancia al K+ por acción de las catecolaminas (Miledi y Woodward, 1989), pero sólo si están presentes las células foliculares.

Los experimentos en los que se emplearon agonistas y antagonistas adrenérgicos permiten determinar que el efecto metabólico de la adrenalina se produce por interacción con receptores de tipo b 2. Así, el uso de ritodrine (agonista adrenérgico b 2 específico) en condiciones experimentales tanto "in vivo" como "in vitro", induce efectos similares a los obtenidos con la adrenalina, mientras que el tratamiento con xylometazoline (agonista adrenérgico a ), no altera el comportamiento metabólico de los ovocitos. Datos que demuestran la presencia de receptores b adrenérgicos específicos (tipo b 2) en ovarios de mamíferos (Aguado y Ojeda, 1986; Spicer, 1986) apoyarían nuestros resultados.

La capacidad de los agonistas adrenérgicos b para determinar un metabolismo típico del período reproductor se puede relacionar con el efecto estimulante de estos agentes en la actividad de la glucosa 6-fosfato deshidrogenasa (G-6-PDH) (Zimmer y col., 1990), enzima clave en la oxidación de la glucosa por la vía de las pentosas fosfato. Al respecto, cabe destacar que esta ruta metabólica es predominante en los ovocitos del período reproductor (Legname y Salomón de Legname, 1980).

El uso de propranolol, antagonista adrenérgico b , bloquea la disminución del índice C/F inducida por la adrenalina y el ritodrine. Estos resultados apoyarían los datos obtenidos con el agonista b 2 y reforzarían la hipótesis de que el efecto metabólico de la adrenalina se lleva a cabo a través de este tipo de receptores. Sin embargo, en nuestro modelo experimental no se puede explicar el hecho de que el propranolol no afecta en forma significativa el incremento del índice C/F producido por la noradrenalina.

Los estudios realizados permiten concluir que la adrenalina es uno de los factores determinantes de la maduración citoplasmática en ovocitos de Bufo arenarum. Teniendo en cuenta que tanto la FSH así como la adrenalina, a través de su interacción con receptores b , ejercen fisiológicamente su acción incrementando los niveles intracelulares de AMPc se confirma que la maduración citoplasmática es un proceso dependiente de este segundo mensajero.

En relación a la participación de los esteroides gonadales en el proceso de maduración citoplasmática, nuestros resultados demuestran que el 17 b -estradiol produce un efecto dual, incrementando el índice C/F en los ovocitos del período de reposo y disminuyendo dicho índice en el período reproductor. Aun cuando no contamos con una explicación satisfactoria para estos resultados cabe recordar que a nivel hipofisario el estradiol posee también un efecto dual ya que, dependiendo de las concentraciones, puede actuar como regulador positivo o negativo. Existe también la posibilidad de que la respuesta a los estrógenos pueda variar con el estado del ciclo ovárico (Pavgi y Licht, 1993) o bien guarden relación con las fluctuaciones en los niveles circulantes del esteroide, bajos durante el período de reposo comparados con los del período reproductor.

Con respecto a la progesterona, al menos en nuestras condiciones experimentales, los resultados indican que esta hormona no participa en la maduración citoplasmática.

CONTROL DE LA MADURACION NUCLEAR

1- Factores inhibidores

Nuestros resultados al incubar folículos con dbAMPc o IBMX demuestran que los mismos no tienen efecto directo sobre la maduración nuclear. Sin embargo, estos compuestos que mantienen elevados los niveles intracelulares de AMPc, bloquean la maduración nuclear inducida por progesterona. Estos datos coinciden con las observaciones realizadas en mamíferos (Eppig y Downs, 1984) y anfibios (Kwon y col., 1989).

Es importante señalar que tanto la FSH como la adrenalina, que actúan vía de AMPc, exhiben un comportamiento similar. El efecto inhibitorio producido por la adrenalina podría deberse no sólo a un incremento intracelular del segundo mensajero, sino también a una hiperpolarización de la membrana plasmática a consecuencia de un incremento en la permeabilidad al K+, como fue observado en ovocitos de Xenopus (Miledi y Woodward., 1989). A su vez, la inhibición obtenida con el IBMX podría explicarse por su acción sobre un tipo específico de fosfodiesterasa (Tsafriri y col., 1996).

Es decir que si bien el AMPc produciría una acción estimulante de la maduración citoplasmática, actuaría como un inhibidor fisiológico de la maduración nuclear.

Durante el período reproductor y en respuesta al incremento de las gonadotrofinas hipofisarias (Houssay, 1947), las células foliculares sintetizan y liberan esteroides ováricos (Fortune, 1983) que juegan un rol importante en el proceso de maduración nuclear.

Analizando el efecto producido por el 17 b -estradiol se observa que en Bufo arenarum, al menos en las dosis y tiempos ensayados, la hormona por sí sola no afecta a la vesícula germinal en concordancia a lo manifestado para esta especie por Villecco y col. (1996). Sin embargo, el pretratamiento de folículos con estradiol produce inhibición de la maduración nuclear inducida por progesterona, siendo este efecto dependiente de la dosis de estradiol empleada y del tiempo de incubación. Nuestros datos coinciden con los encontrados por Lin y Schuetz (1983) en ovocitos de Rana pipiens desprovistos de células foliculares. Este efecto inhibidor probablemente se debe a la acción estabilizante que los estrógenos producen en las propiedades viscoelásticas del ooplasma, dificultando de esta manera la migración de la VG (Lessman, 1987).

Es decir que, aparentemente el estradiol estaría más involucrado en el control de la maduración nuclear que en la inducción de este proceso.

2- Factores estimulantes

En la mayoría de las especies de anfibios la progesterona es la hormona inductora de la maduración nuclear (Jalabert y col., 1991). Se conoce que el esteroide ejerce su acción al interactuar con receptores en la superficie del ovocito (Liu y Patiño, 1993; Bandyopadhyay y col., 1998). Como consecuencia de esta interacción se desencadena una serie de eventos que llevan a la reiniciación de la meiosis mediante una disminución transitoria de los niveles intracelulares de AMPc, causada por una inhibición de la adenilato-ciclasa (Maller, 1985; Smith, 1989) o por activación de la fosfodiesterasa (Sadler y Maller, 1989).

Resultados previos de nuestro laboratorio, no publicados en este trabajo, sugieren que en Bufo arenarum el mecanismo de acción de la progesterona sería el mismo que el descripto para otras especies de anfibios. En efecto, la acción de la hormona sólo se pone de manifiesto cuando se tratan los folículos con el esteroide, mientras que las vesículas germinales aisladas e incubadas con progesterona se mantienen intactas durante todo el período de experimentación (24 hs.).

En el presente trabajo se demuestra que la sensibilidad de los ovocitos a la progesterona varía según los períodos del ciclo sexual de Bufo arenarum. En el período reproductor se observa la mayor respuesta a la hormona puesta de manifiesto por altos porcentajes de ruptura de la VG, obtenidos con menores tiempos de incubación y bajas concentraciones del esteroide.

Las variaciones en la sensibilidad podrían estar relacionadas con los niveles circulantes de progesterona durante el ciclo sexual de Bufo arenarum. Nuestros resultados evidencian que las menores concentraciones del esteroide corresponden al período de reposo. Coincidentemente, en este período, la progesterona actúa sólo cuando se utilizan dosis altas y prolongados tiempos de incubación. El máximo efecto se observa durante el período reproductor, cuando son mayores los niveles de progesterona circulante. Cabe señalar que los valores de concentración hormonal obtenidos en Bufo arenarum durante los períodos analizados concuerdan con los determinados para Bufo japonicus (Itoh e Ishii, 1990).

Una segunda alternativa es considerar que, durante el período reproductor, fisiológicamente el ovocito totalmente crecido es blanco de la acción de numerosas hormonas, las que actuando en forma concertada podrían permitir la adquisición de un estado competente para responder a la progesterona.

Aun cuando la progesterona sea considerada la hormona que fisiológicamente desencadena la reiniciación de la meiosis, nuestras observaciones demuestran que la dihidrotestosterona (DHT), andrógeno con niveles circulantes muy altos en las hembras de Bufo arenarum (Fernández y col., 1984) es también un inductor de la maduración nuclear. Es importante señalar que en Scaphiopus couchii se ha demostrado un incremento en los niveles de DHT durante el período inmediato previo al amplexus (Harvey y col., 1997), etapa en la que se produciría secuencialmente la maduración nuclear y la ovulación.

En algunas especies de mamíferos (Totey y col., 1996) y anfibios (El Etr y col., 1979; Lessman y Marshall, 1984) se ha comprobado que la función ovárica está regulada no sólo por las gonadotrofinas, sino también por la acción concertada con otras hormonas proteicas entre las que se encuentra la insulina. En efecto, la hormona pancreática jugaría un rol importante en la fisiología de la gónada favoreciendo la respuesta del ovario a las gonadotrofinas y estimulando la esteroidogénesis (Srivastava y van der Kraak, 1994).

Nuestros resultados indican que la insulina "per se" es efectiva en inducir la maduración nuclear sólo a altas concentraciones y con tiempos de incubación prolongados. Esto concuerda con lo observado en ovocitos de Xenopus y podría explicarse considerando que la acción hormonal está mediada, en estas especies, por receptores de baja afinidad (Maller y Koontz, 1981), o bien que estas condiciones de incubación son necesarias para que la insulina sea efectiva en inducir la liberación de progesterona por las células foliculares. Esta última posibilidad explicaría porque los ovocitos desnudos de Xenopus no responden al tratamiento con insulina sola (Le Goascogne y col., 1985).

Cuando en nuestro sistema experimental asociamos insulina con progesterona, ambas en dosis subliminales, se obtienen altos porcentajes de ruptura de VG. Resultados similares fueron descriptos en ovocitos desnudos de Xenopus (Le Goascogne y col., 1987). Esto sugiere que el efecto sinérgico de ambas hormonas no depende de la presencia de las células foliculares.

De nuestros datos se deduce que un corto tiempo de incubación con bajas dosis de insulina produce un marcado efecto de potenciación con progesterona. Asimismo, el efecto sinérgico de ambas hormonas es menos aparente cuando se incrementan las concentraciones de progesterona, probablemente porque dosis crecientes del esteroide son cada vez más efectivas para inducir ruptura de VG por sí mismas.

Indudablemente la acción de la insulina facilitando la ruptura de la VG a bajas concentraciones de progesterona, reviste un gran interés fisiológico.

Es importante destacar que la asociación de progesterona e insulina fue también efectiva en inducir la ruptura de VG en ovocitos en estadío de vitelogénesis tardía, etapa de la ovogénesis en la que progesterona por sí sola no tiene efecto. Estos resultados sugieren que si bien, a partir del estadío de auxocitosis la insulina potencia el efecto de progesterona, en una etapa previa del desarrollo gonadal la hormona proteica determina, por mecanismos no conocidos, la adquisición de la capacidad para responder a la progesterona.

Es decir que a nivel de los ovocitos de Bufo arenarum la insulina evidencia, respecto a la progesterona, sinergismo de potenciación y capacidad de inducir sensibilidad al esteroide.

3- Cambios subcelulares durante la maduración nuclear inducida por progesterona

Los estudios realizados durante la maduración nuclear inducida por progesterona permiten observar importantes modificaciones estructurales a nivel citoplasmático y nuclear, recién a partir de las 3 hs. de tratamiento hormonal. A este tiempo la VG comienza la migración hacia la superficie del polo animal. Este proceso que constituye uno de los primeros parámetros indicativos de la reiniciación de la meiosis (Upadhyaya y Haider, 1986), se completa a las 5 – 6 hs. de tratamiento hormonal, cuando el núcleo alcanza la superficie del ovocito, posición que facilita la expulsión del primer corpúsculo polar.

Se ha propuesto que el desplazamiento de la VG se produciría como consecuencia de cambios determinados por la progesterona en la disposición de los microtúbulos responsables de mantener la posición del núcleo en la célula (Lessman, 1987; Giunta y col., 1996).

La finalización del proceso de migración coincide con la formación del espacio perivitelino como consecuencia de la retracción de las microvellosidades y el aplanamiento de la superficie del polo animal.

Simultáneamente con el inicio de la migración de la VG los gránulos de glucógeno, previamente dispersos en el citoplasma, tienden a formar acúmulos algunos de los cuales son endocitados en vesículas, las que posteriormente se distribuyen a nivel cortical o son liberadas al espacio extracelular. Estos resultados concuerdan con los obtenidos en los ovocitos de los urodelos Pleurodeles waltlii y Ambystoma mexicanun (Taghy-Sadak y Vilain, 1985). Respecto a los anfibios anuros los datos obtenidos en la única especie estudiada, Xenopus laevis, no muestran imágenes similares a las observadas en urodelos (Taghy-Sadak y Vilain, 1985). El significado biológico de este proceso, que en el presente trabajo se describe por primera vez en ovocitos de anuros, no ha sido aún dilucidado. Sin embargo se puede sugerir que el glucógeno al incorporarse a vesículas citoplasmáticas o al asociarse a cuerpos multilamelares, determina la formación de depósitos de membranas y material energético, probablemente requeridos durante el desarrollo embrionario.

Otro proceso inducido por la progesterona es la disrupción de las laminillas anulares, dando lugar a la formación de numerosas vesículas que comienzan a migrar hacia el cortex donde forman una desarrollada red de retículo endoplasmático. En Xenopus laevis se ha propuesto que tanto las laminillas anulares como la red de retículo endoplasmático representarían posibles sitios de secuestro de calcio (Andreuccetti y col., 1984).

Esta sugerencia fue confirmada en Bufo arenarum. En efecto, los resultados obtenidos mediante técnicas ultrahistoquímicas permitieron detectar la localización de depósitos de calcio en los espacios intracisternales de las laminillas anulares y del retículo endoplasmático.

El mecanismo de incorporación del catión en estos depósitos ha sido relacionado, en huevos de erizo, con un sistema dependiente de ATP (Terasaki y Sardet, 1991). Sin embargo el tipo de transporte involucrado no ha sido identificado. Nuestros resultados en Bufo arenarum, que determinan la presencia de Ca-ATPasa activa, indican que el secuestro de calcio en las organelas membranosas estaría mediado por esta proteina.

La presencia de estos depósitos de calcio en el cortex puede relacionarse con la migración de los gránulos corticales a una posición más superficial. Por acción de la progesterona, los gránulos corticales se translocan hasta formar una monocapa en la proximidad de la membrana plasmática. Esta localización permite establecer una estrecha relación entre estas organelas y los elementos del retículo endoplasmático que contienen calcio en su interior. La relación morfológica entre ambas estructuras adquiere importancia funcional al considerar que de esta manera se proveería el calcio necesario para la exocitosis del contenido de los gránulos corticales inducida por la penetración del espermatozoide (Terasaki y Sardet, 1991; Stricker y col., 1998). De esta manera se forma la membrana de fecundación que asegura la fecundación monospérmica, iniciándose a continuación el desarrollo embrionario.

Los resultados obtenidos en este trabajo constituyen un aporte al conocimiento de la regulación del proceso de maduración del ovocito y proporciona nuevas direcciones tendientes a la comprensión de algunos aspectos de la fisiología y farmacología de la reproducción. Es factible suponer que los sistemas de control y los procesos descriptos bajo condiciones "in vitro", ocurran fisiológicamente "in vivo". Son necesarias futuras investigaciones a fin de profundizar el significado fisiológico integral de estos procesos considerando que, durante el período reproductor de la especie, debe existir una perfecta sincronización entre la maduración, la ovulación y la fecundación y que estos eventos sucedan cuando las condiciones ambientales sean las óptimas para el desarrollo de los nuevos individuos.

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