Bajo esta denominación se consideran los ovocitos presentes en el tejido ovárico. Para su obtención y mantenimiento adecuado, los ovarios fueron disecados inmediatamente después de la inmovilización de las hembras por destrucción medular y separados en porciones que fueron lavadas varias veces en solución de Ringer, a fin de eliminar restos de sangre y tejido lesionado. Posteriormente se colocaron en solución de Ringer conteniendo antibióticos (sulfato de estreptomicina 0,50 g/l y penicilina G sódica 0,30 g/l), hasta el momento de ser usados.

Los ovocitos celómicos se obtuvieron mediante la técnica de ovulación "in vivo" a partir de hembras adultas climatizadas durante 24 hs. a 22 – 24ºC, a las que se les ligó el oviducto a la altura del ostium bajo anestesia con éter. Luego de un período de 12 hs. se indujo la ovulación inyectando en el saco linfático dorsal una suspensión de hipófisis homóloga (1 hipófisis/animal) (Houssay, 1929). La suspensión fue siempre preparada a partir de hipófisis recientemente extraídas (50%) e hipófisis conservadas según Pisanó (1956) (50%). Los animales se mantuvieron durante 8 a 10 hs. a 25 ± 1ºC y al cabo de ese tiempo se sacrificaron por destrucción medular. Los ovocitos liberados hacia la cavidad pleuroperitoneal, rodeados sólo por su envoltura vitelina, fueron tomados cuidadosamente y depositados en cajas de Petri conteniendo solución de Ringer con antibióticos. Cada ovulación fue controlada, usándose sólo aquellos ovocitos que no presentaban signos de activación.

En nuestro diseño experimental representan ovocitos totalmente crecidos con un diámetro de 1,5 a 1,7 mm, rodeados solamente por las células foliculares. Los mismos fueron aislados del ovario utilizando pinzas de relojero, bajo microscopio estereoscópico.

2.4- Glándula pineal

Las glándulas pineales fueron disecadas a partir de hembras recientemente capturadas. La técnica consistió en realizar una incisión en la región anterosuperior de la cabeza, seccionando luego el hueso frontoparietal en sentido longitudinal. Al abrir la caja craneana queda expuesta la masa encefálica en cuya zona media, a la altura del techo del diencéfalo y entre las comisuras habenular y posterior, se ubica la pineal.

Para los experimentos que requirieron incubaciones, las glándulas fueron mantenidas en solución de Ringer con antibióticos hasta el momento de la preparación del homogenado correspondiente, realizado en el mismo medio.

Para el análisis histológico las glándulas fueron procesadas según se detalla en técnicas histológicas (6.1).

El suero se obtuvo canalizando el ventrículo de animales recientemente capturados, recogiéndose la sangre en tubos de centrífuga. Las muestras se mantuvieron 1 hora a temperatura ambiente, y una vez formado el coágulo se centrifugaron a 3.000 x g durante 10 min. en centrífuga refrigerada Eppendorf. El suero fue usado inmediatamente o fraccionado y conservado a –20 ºC hasta su uso.

Previo a la preparación de la fracción mitocondrial, porciones de ovario o bien ovocitos de cavidad fueron incubados en 50 ml de solución de Ringer con antibióticos. A este medio se le adicionaron las hormonas o drogas en estudio.

Todos los tratamientos se llevaron a cabo a 25 ± 1ºC por períodos de tiempo variables preestablecidos para cada experimento. Las respectivas muestras controles fueron mantenidas en solución de Ringer en idénticas condiciones, y una vez finalizado el tiempo muestras controles y tratadas fueron procesadas para el aislamiento de mitocondrias según se detalla en 4.1.

La fracción mitocondrial fue obtenida por centrifugación diferencial a partir de homogenados de tejido ovárico o de ovocitos celómicos, de acuerdo al siguiente esquema experimental:

Hembras adultas

Ovocitos ováricos Ovocitos de cavidad

25 ± 1°C

Homogeneización en 50 ml de Sacarosa 0,5 M en EDTA 1 mM, pH 7,4

Filtración

Sobrenadante

Centrifugación (13.000 x g, 10 min.)

Las centrifugaciones se llevaron a cabo en centrífuga refrigerada Sorvall RC2B entre 0 y 3ºC.

El comportamiento metabólico de los ovocitos fue evaluado determinando la capacidad de las mitocondrias aisladas para oxidar citrato y fumarato como intermediarios del ciclo de Krebs. Con este propósito, se usó un sistema compuesto por buffer fosfato de potasio (0,1M), MgCl₂ (10,4 m moles), citocromo C (0,12 m moles), NAD (1,3 m moles), ATP (3,7 m moles) y como sustrato citrato o fumarato (45 m moles). A este medio, ajustado a pH 7,4, se le agregó 2 ml de la fracción mitocondrial alcanzando de esta manera un volumen final de 3,2 ml.

Los sustratos fueron preparados neutralizando los correspondientes ácidos con KOH en presencia de rojo fenol. La concentración de citrato o fumarato usada permitió asegurar la saturación de la capacidad oxidativa del sistema.

Dicha capacidad fue estimada midiendo el consumo de oxígeno a 25ºC, en un manómetro de Warburg. Los vasos de reacción fueron agitados a 80 ciclos/min. con una amplitud de 7 cm. El CO₂ producido durante el período experimental fue absorbido con KOH 20%. Con la finalidad de calcular la respiración mitocondrial endógena se usó buffer fosfato como blanco de reacción.

Los valores, obtenidos por duplicado, fueron expresados como m moles de oxígeno consumidos/mg proteinas/30 min.

La concentración de proteínas fue determinada por el método de Lowry y col. (1951) usando seroalbúmina bovina como estándar.

4.3- Radioinmunoanálisis (RIA)

Para la detección de los niveles circulantes de hormonas gonadotróficas y esteroideas en hembras adultas de Bufo arenarum, se utilizaron técnicas de radioinmunoanálisis (RIA). Con este propósito, en los períodos de reposo y reproductor, se tomaron lotes de diez animales de los cuales se obtuvo el suero inmediatamente después de su captura.

La medición de los niveles séricos de FSH y LH se realizó empleando un kit comercial provisto por Radiochemical Center, Amershan, England.

Las determinaciones se realizaron por triplicado incubando el suero, sin previa extracción, en una dilución 1:5 en presencia de ¹²⁵I-LH y ¹²⁵I-FSH.

La concentración de hormonas en las muestras se midió en relación a la curva testigo preparada con el estándar de referencia en el rango entre 0,1 y 8 mUI/ml. La radioactividad se determinó en un contador Gamma Automático LKB.

La variación intraensayo fue de 4,5% y 3,9% y la variación interensayo fue de 3,8% y 3,3% para FSH y LH respectivamente.

Los niveles de estradiol sérico se determinaron mediante la técnica de Abraham (1975) adaptada por Fernández y col. (1984), usando un antisuero específico provisto por el Max-Planck Institute. Alícuotas de suero extraídas con éter dietílico fueron incubadas en buffer fosfato-gelatina pH 7,4 con el antisuero (dilución 1:15.000) y ³H-estradiol (actividad específica 90 Ci/mmol). La curva estándar se preparó con estradiol en el rango de 12,5 – 800 pg y se procesó en forma análoga. Luego de incubar 12 hs. a 4ºC se separó la hormona libre de la unida mediante el agregado de una suspensión de carbón-dextrán (CD) (Norit A 0,5% - Dextrán T 70 0,05% peso/volumen) en buffer fosfato sin gelatina. El sobrenadante de la centrifugación a 3.000 rpm fue transferido a viales conteniendo Omnifluor, para medir la radioactividad en contador de centelleo líquido LS 100 Beckman. El límite de detección del método fue de 12,5 pg y la variación intra e interensayo fue de 5% y 10% respectivamente.

Para determinar los niveles de progesterona, alícuotas de suero extraídas con hexano fueron incubadas por triplicado en buffer fosfato-gelatina pH 7,4 con el antisuero específico provisto por Sigma (dilución 1:20.000) y ³H-progesterona (actividad específica 100 Ci/mmol). Paralelamente se preparó la curva estándar en el rango de 50 – 6.400 pg de progesterona. Luego de incubar 24 hs. a 4ºC, a cada tubo

se le agregó CD (0,5% - 0,05% peso/volumen) suspendido en buffer fosfato sin gelatina. Luego de incubar 10 min. en frío, se centrifugó a 3.000 rpm 10 min. y el sobrenadante se transfirió a viales para determinar la radioactividad en contador de centelleo líquido LS 100 Beckman.

El límite de detección fue de 5 pg, la variación intraensayo de 6,9% e interensayo de 8%.

La sensibilidad del método fue de 12,5 pg y los coeficientes de variación intra e interensayo fueron menores del 12%.

La capacidad de las mitocondrias aisladas de ovocitos ováricos y celómicos para oxidar citrato y fumarato como intermediarios del ciclo de Krebs, fue usada como parámetro indicativo del estado de maduración citoplasmática. Los resultados obtenidos fueron expresados como la relación entre la velocidad de oxidación de citrato y la velocidad de oxidación de fumarato, a la que se denomina índice C/F (Legname y Salomón de Legname, 1980). Durante el período de reposo esta relación es aproximadamente ³ 1 lo que se considera como expresión de un ovocito citoplasmáticamente inmaduro, mientras que durante el período reproductor la relación C/F cuyo valor varía entre 0,3 y 0,6, evidencia un ovocito citoplasmáticamente maduro (Legname y Bühler, 1978).

Como indicador de maduración nuclear se consideró la reiniciación de la meiosis, cuya manifestación morfológica es la migración del núcleo o vesícula germinal (VG) hacia la superficie del polo animal y la posterior disolución de la envoltura nuclear con la consecuente desaparición del núcleo. Los resultados de este proceso fueron expresados como porcentajes de ruptura de VG.

6.1- Microscopía óptica

El estudio histológico de la glándula pineal se realizó en ejemplares recientemente capturados. Una vez inmovilizado el animal por destrucción medular y expuesta la glándula, según se detalla previamente, se realizó la fijación "in situ" con fijador de Bouin durante 30 - 45 min. Luego, con el propósito de preservar su morfología, se extrajo parte de la masa encefálica que contiene a la glándula y se continuó con la fijación a través de dos etapas: la primera en frío (4 - 5ºC), durante 90 min. y posteriormente a temperatura ambiente por el mismo lapso de tiempo. Concluida la fijación la muestra fue lavada con alcohol 50º y mantenida en alcohol 70º (no más de 24 – 48 hs.) hasta el momento de ser procesada. Posteriormente, sobre portaobjeto tibio conteniendo una gota de agar al 1% recientemente preparado, se colocó la muestra agregándose luego otra gota de agar semisólido. Luego de deshidratar la muestra a través de pasajes en alcoholes de graduación creciente e incluirla en parafina, se realizaron cortes de aproximadamente 5 - 7 m m a los que se coloreó con hematoxilina-eosina. Las observaciones se realizaron en un microscopio Zeiss MC 80.

Para el análisis de los cambios citológicos producidos durante el proceso de

maduración nuclear, lotes de folículos controles y tratados seleccionados al azar, fueron fijados en Ancel y Vintemberger durante 24 - 48 hs. a 4ºC. Posteriormente las muestras fueron deshidratadas gradualmente con una serie de alcoholes de graduación creciente hasta alcohol de 96º, completándose el proceso con 3 baños de butanol de 5 min. cada uno. La inclusión se realizó en Paraplast a 60ºC según la técnica de Manes y Nieto (1983) para ovocitos con alto contenido de vitelo. Las muestras fueron seccionadas en cortes de 5 a 7 m m de espesor y coloreadas con la coloración tricrómica de Masson.

El estudio histológico del ovario se realizó en porciones de la gónada fijadas en Ancel y Vintemberger durante 48 hs. en frío. Posteriormente las muestras fueron incluidas en Paraplast y seccionadas en cortes de aproximadamente 7 – 8 m m de espesor. Los preparados se colorearon con hematoxilina-eosina durante 1 min.

6.2- Microscopía electrónica de transmisión

Para el análisis de las modificaciones subcelulares relacionadas con la maduración nuclear, los folículos fueron fijados en glutaraldehido al 3% en buffer fosfato 0,1 M pH 7,4 durante 3 hs. a 4 - 5ºC. Cumplido el tiempo, los casquetes correspondientes al polo animal de los ovocitos fueron cortados, lavados en buffer fosfato y postfijados en tetróxido de osmio al 1% en el mismo buffer a 4ºC, durante toda la noche. Las muestras fueron deshidratadas gradualmente en una serie de alcohol etílico de graduación creciente e incluidas en resina Spurr (Pelco Int.; Redding CA). Los cortes finos fueron realizados mediante un ultramicrótomo Potter Blum M T 1, coloreados con acetato de uranilo y citrato de plomo y observados con microscopio electrónico Zeiss EM 109.

Para la localización subcelular de calcio iónico se empleó el método de Spicer y col. (1968). Los ovocitos fueron fijados durante 2 hs. a 4ºC en una solución conteniendo piroantimoniato de K⁺ al 2% y tetróxido de osmio al 2% (1:1 v/v) ajustado a pH 7,8 con KOH 0,05 N. Como controles se usaron muestras fijadas en tetróxido de osmio al 1%.

Cumplido el tiempo de fijación las muestras fueron lavadas con agua desionizada fría y procesadas con la técnica de rutina para microscopía electrónica.

El calcio que precipita con el piroantimoniato de K⁺ se observa como depósitos electrónicamente opacos.

Teniendo en cuenta que el piroantimoniato puede también precipitar en menor grado otros cationes, la naturaleza de los depósitos de antimonio fue evaluada por tratamiento previo de los cortes finos con EGTA 3 mM.

La localización de Ca-ATPasa activa fue determinada por microscopía electrónica de transmisión. Los ovocitos fueron fijados en una mezcla de glutaraldehido al 1% en buffer cacodilato de Na 0,1 M pH 7,4, durante 2 hs. a 4ºC y posteriormente lavados en buffer cacodilato 0,1 M pH 7,4, durante 3 hs. a 4ºC. Las muestras fueron luego incubadas en el mismo buffer más EDTA 10 mM durante 30 min. a temperatura ambiente, a fin de remover el calcio presente. Después del lavado en buffer cacodilato sin EDTA, todas las secciones fueron incubadas acorde al método de Ando y col. (1981). El medio de incubación consistió en una solución compuesta por: buffer glicina - KOH 250 mM pH 9,0, ATP 3 mM, CaCl₂ 10 mM como activador, citrato de plomo 2 mM y L-tetramisol 2,5 mM como inhibidor de fosfatasa alcalina. Los controles fueron procesados paralelamente omitiendo CaCl₂. Las incubaciones se realizaron durante 30 min. a temperatura ambiente. Posteriormente las muestras fueron lavadas con buffer cacodilato 0,1 M, postfijadas con tetróxido de osmio al 1% en el mismo buffer durante 1 hora y deshidratadas en una serie gradual de alcoholes y acetona e incluidas en Spurr.

La presencia de Ca-ATPasa activa se observa como depósitos electrodensos.

Las microfotografías que ilustran los resultados fueron obtenidas con un equipo fotográfico Zeiss MC 80 utilizando películas Tri-X-PAN y T MAX (Kodak), con una sensibilidad de 100 a 400 ASA.

Las hormonas y drogas utilizadas, salvo las especificaciones particulares, fueron obtenidas de Sigma Chemical Company.

De las soluciones conservadas como stock o preparadas en el momento del uso como solución patrón, se tomaron las alícuotas correspondientes para alcanzar la concentración final preestablecida en cada experimento.

Los datos experimentales, obtenidos por duplicado o triplicado, son presentados como la media ± ES del número de experimentos indicado en cada leyenda. El test de Student o test de t fue utilizado para determinar la significancia de las diferencias entre las muestras controles y tratadas, considerando P < 0,05 estadísticamente significativo.

El número de animales utilizados y la duración de los tratamientos se indica en la leyenda de cada figura o tabla.

Na Cl 113,0 mM

CaCl₂ 1,3 mM

KCl 2,0 mM

Formol 10,0%

Acido acético 0,5%

NaCl 0,5%

Acido pícrico 75,0 ml

Formol 20,0 ml

Acido acético glacial 5,0 ml

Na₂HPO₄ 40,0 mM

NaH₂PO₄ 34,0 mM

NaCl 154,0 mM

Azida de Na 0,1 %

Gelatina 0,1 %