2- REGULACION HORMONAL DE LA MADURACION NUCLEAR 

2.1- ROL DE HORMONAS ESTEROIDEAS 

2.1.a- Efecto de progesterona 

            En Bufo arenarum, como en la mayoría de las especies de anfibios, la progesterona es la hormona que gatilla la reiniciación de la meiosis o maduración nuclear, expresada morfológicamente por la ruptura del núcleo o vesícula germinal (VG). Teniendo en cuenta que fisiológicamente la maduración y posterior ovulación son procesos restringidos sólo al período reproductor, se consideró conveniente estudiar en nuestras condiciones “in vitro” la diferente sensibilidad de los ovocitos a la acción de la progesterona, con el propósito de establecer la mínima dosis capaz de producir maduración en los dos períodos del ciclo analizados.

            Para ello los folículos aislados durante los períodos de reposo y reproductor, según se detalla en 2.3 de Materiales y Métodos, fueron incubados en 30 ml de solución de Ringer en presencia de dosis crecientes (0,01 - 2 mg/ml) de progesterona.  Folículos controles fueron incubados en las mismas condiciones sin el agregado de la hormona. El estado de la VG fue controlado a intervalos de 2 hs. durante el período experimental (24 hs.).

            Los resultados obtenidos durante el período de reposo (Fig. 12 A) indican que la dosis mínima ensayada (0,01 mg/ml) prácticamente no tiene efecto en la maduración nuclear. La incubación con concentraciones crecientes de la hormona induce un efecto dosis y tiempo dependiente, obteniéndose un porcentaje de ruptura de VG que oscila entre 37 - 71% a las 24 hs. de incubación para las concentraciones de progesterona en el rango de 0,05 – 0,5 mg/ml. Sólo con las dosis máximas ensayadas (1 y 2 mg/ml) se obtiene en el mismo período de tratamiento, el 100% de ruptura de VG (P < 0,01).

            Cuando se analizó la respuesta de folículos obtenidos durante el período reproductor se pudo observar (Fig. 12 B), un 50% de ruptura de VG a las 24 hs. de incubación con la menor dosis utilizada (0,01 mg/ml). A partir de la concentración de 0,1 mg/ml se obtuvo un 100% de ruptura de VG en igual período de tratamiento (P < 0,01).

            Es importante destacar que, a diferencia de lo que ocurre en el periodo de reposo, durante el periodo reproductor se observa, entre las 4 a 6 hs. de incubación, una notable respuesta a la hormona.

2.1.b- Efecto de 17 b-estradiol  

            La influencia de estradiol sobre la maduración nuclear fue analizada utilizando folículos aislados de hembras capturadas durante el período reproductor. Los folículos fueron distribuidos al azar en lotes de a pares e incubados en solución de Ringer conteniendo 17 b-estradiol en las siguientes dosis: 6, 12 y 24 mg/ml. Al cabo de 1 hora a uno de los lotes de cada par se le añadió progesterona (0,1 mg/ml) como inductor de maduración nuclear.

            En esta serie de experimentos se usó como control folículos incubados en solución de Ringer. Paralelamente se ensayó una muestra sólo con progesterona (0,1 mg/ml).

            A las 12 y 24 hs. de tratamiento aproximadamente 60 folículos de cada uno de los lotes ensayados fueron fijados para determinar el porcentaje de ruptura de VG.  

Tabla 3

Efecto de 17 b-estradiol en la maduración nuclear

Folículos obtenidos de hembras recolectadas durante el período reproductor fueron incubados según se indica en el texto. Los valores representan la media de experimentos realizados con animales diferentes (n = 5).

            Los datos (Tabla 3), demuestran que la incubación con 17 b-estradiol no afecta la maduración nuclear en los dos períodos de tratamiento adoptados y con ninguna de las dosis ensayadas. Por otra parte, cuando los folículos fueron preincubados durante 1 hora con este esteroide, se observó que el mismo produce un marcado efecto inhibidor de la maduración nuclear inducida por progesterona. Esta inhibición fue evidente con las tres dosis de estradiol estudiadas.

            Es importante destacar que la mayor inhibición por acción de estradiol se manifiesta durante las primeras 12 hs. de tratamiento (P < 0,01). A las  24 hs. de incubación esta inhibición es menos marcada, para las tres dosis de estradiol ensayadas.

            Resultados obtenidos con folículos aislados de hembras capturadas en el período de reposo muestran una tendencia similar.

2.1.c- Efecto de DHT

            En base a los resultados obtenidos con progesterona y 17 b-estradiol y considerando que los dosajes de DHT revelan elevados niveles circulantes en la hembra de Bufo arenarum, se analizó el efecto de esta hormona en el proceso de maduración nuclear.

            Folículos aislados fueron incubados en presencia de DHT en concentraciones entre 0,01 y 2 mg/ml. El porcentaje de ruptura de la VG se determinó a intervalos regulares en un lapso de 24 hs.

            Los resultados obtenidos (Fig. 13) demuestran que, a diferencia de la progesterona, una respuesta significativa (P < 0,01) en el período reproductor se logra recién a partir de la dosis de 0,1 mg/ml con un 60% de ruptura de VG en 24 hs. de tratamiento. Si bien con las mayores concentraciones de DHT ensayadas (1 y 2 mg/ml) se obtiene un 100% de ruptura de VG en ambos períodos, este efecto se logra más tardíamente que con progesterona.

            Los resultados obtenidos al tratar con DHT folículos del período de reposo muestran una tendencia similar.

2.2- RELACION ENTRE  MELATONINA Y MADURACION NUCLEAR

            A fin de analizar la acción de la melatonina en el proceso de maduración nuclear, folículos ováricos fueron incubados durante 1 hora en solución de Ringer conteniendo la hormona en las dosis previamente determinadas como efectivas para inducir cambios metabólicos en ovocitos de los períodos de reposo y reproductor (1,8 y 3 mg/ml respectivamente). Cumplido el tiempo de incubación se adicionó progesterona al medio (0,1 y 0,5 mg/ml) para inducir la maduración nuclear

            A partir del agregado de la progesterona, por un lapso de 24 hs. y con frecuencia de 2 hs., lotes de folículos fueron fijados para el posterior examen de la vesícula germinal.

            Como controles, lotes de folículos fueron incubados en presencia de Ringer con y sin el agregado de melatonina y/o progesterona en las dosis antes mencionadas, y procesados en idénticas condiciones.