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membrana vitelina | Efectos líticos sobre la membrana vitelina | Efecto de la activación  sobre la acción lítica | Lisinas en  sobrenadantes de suspensiones de espermatozoides | Relación de la lisina con los espermatozoides | Ausencia de especificidad de especie | Inhibición  de la lisina por  inhibidores de proteinasas | Algunas propiedades de la lisina | Inhibición de la lisina por  la Concanavalina A | Acción de la concanavalina A sobre la fecundación | Inhibición del efecto de la Concanavalina A 

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   Como ya fuera mencionado cuando el ovocito de anfibio es liberado del ovario se halla rodeado por una cubierta extracelular llamada "membrana vitelina". La estructura de esta membrana, poco conocida todavía, no corresponde a la de una membrana plasmática. Otros nombres utilizados para designar a esta misma envoltura son : membrana ovocitaria, cubierta vitelina, involucro vitelino y corión, reservados generalmente para invertebrados y vertebrados inferiores. La estructura correspondiente de los mamíferos recibe el nombre de zona pelúcida o membrana pelúcida. Provisoriamente es preferible mantener la denominación de membrana vitelina para designar esta capa que según lo señala Wischnitzer (), rodea al ovocito en el período comprendido entre la ovulación y la fecundación. Sin embargo creemos que en el futuro será necesario rever esta denominación, dado que el caracterizar a esta membrana como "vitelina" lleva a confusión debido a que este termino se asocia fácilmente con el material de reserva del ovocito, llamado vitelo y, por otra parte, según lo señala Wolf (), no sería ni siquiera correcto denominarla membrana.

   Existen pocos datos bibliográficos acerca de la naturaleza de este involucro. Se origina probablemente como resultado de una interacción de las células foliculares y el ovocito durante la ovogénesis (). Es sensible a las enzimas proteolíticas (, ) y a los agentes reductores de S-S (). En Xenopus laevis se han identificado algunos componentes macromoleculares por filtración en gel y electroforesis (, ). En nuestro laboratorio hemos comprobado recientemente que resulta fácilmente soluble en ácido y álcalis.

   En el ovocito no fecundado de los anfibios anuros, la membrana vitelina se encuentra externamente a la plasmática y entre ambas sólo existe un pequeño espacio perivitelino. En el momento de la fecundación, o de la activación del ovocito, los gránulos corticales se rompen, el espacio perivitelino aumenta y en la membrana se producen cambios, que unidos a los que sufrió el córtex, hacen que el ovocito se torne refractario a la penetración por otro espermatozoide (, , ). Este proceso se conoce como reacción preventiva de la polispermia y la membrana vitelina pasa a llamarse membrana o involucro de fecundación. Luego de este proceso, el ovocito rota y al cabo de cierto tiempo se puede apreciar en el polo animal del mismo, la salida del segundo polocito.
   En Xenopus laevis se han aportado datos que indican que el material de los gránulos corticales forma una nueva capa en la superficie externa de la membrana vitelina como resultado de la activación (, , ). En vertebrados y en mamíferos el mecanismo de formación de la membrana de fecundación parece ser mediado a través de proteinasas liberadas por los gránulos corticales (, , , ).
   En Bufo arenarum sabemos que existen gránulos corticales y que, al igual que en otros anuros los mismos se rompen en el momento de la activación (). Sin embargo no hemos encontrado hasta el presente evidencias que indiquen la existencia de una capa adicional en la membrana de fecundación.
   Enzimas encontradas en extractos de espermatozoides de numerosas especies de invertebrados y vertebrados poseen la propiedad de atacar la membrana vitelina del ovocito (o sus análogos) y son conocidas genéricamente con el nombre de lisinas espermáticas o espermatolisinas (). 
   La existencia de estas enzimas juega un papel clave en la fecundación, ya que su intervención es generalmente necesaria para que los espermatozoides puedan atravesar la barrera constituida por la envoltura del ovocito.
   A pesar de haberse señalado la presencia de un gran número de enzimas asociadas al acrosoma del espermatozoide de distintas especies (, , , , , , , , , , , ),en la mayor parte de los casos no se ha de mostrado su relación directa con la fecundación. 
   En los últimos años, se obtuvieron evidencias de que una enzima semejante a la tripsina, presente en el acrosoma de los espermatozoides de mamíferos (), intervendría realmente en la penetración del mismo a través de la zona pelúcida. En aves también se señaló a este mismo tipo de enzimas () como responsables de la penetración del espermatozoide a través de la membrana vitelina del ovocito.

   En anfibios hemos descrito que en los espermatozoides de Leptodactylus chaquensis y Bufo arenarum el contenido del acrosoma está compuesto, por lo menos en parte, por proteinasas acrosómicas y nuestros resultados, coincidentes con los obtenidos en Rana pipiens (, ), aportan evidencias indicativas de que también en estos vertebrados intervendrían en la penetración del espermatozoide.

Efectos líticos de las suspensiones de espermatozoides sobre la membrana vitelina de ovocitos degangados | a Contenidos

   Independientemente del método utilizado para eliminar los involucros gelatinosos, la membrana vitelina de los ovocitos de Bufo arenarum es atacada por las suspensiones de espermatozoides (Tabla 13). El ataque de la membrana vitelina puede observarse claramente bajo microscopio estereoscópico. La secuencia típica del fenómeno (a 22 °C, ovocitos degangados en KCN ) es la siguiente(): aproximadamente 10 minutos después de la adición de los espermatozoides a los ovocitos, la primera reacción que se observa es a nivel del córtex ovocitario. En el mismo se forman pequeñas depresiones que finalmente coalescen dando a la superficie del ovocito un aspecto muy irregular (Fig. 11: b ). A los pocos minutos de iniciado el tratamiento tiene lugar un marcado descenso de la tensión del ovocito. Esto puede ser apreciado fácilmente ejerciendo una ligera presión sobre el mismo por medio de un ansa de cabello, poco tiempo después, el ovocito se colapsa, momento en el que la membrana vitelina puede ser separada con relativa facilidad.

   Luego de una hora, la membrana aparece engrosada y el ataque sobre ella prosigue hasta que, finalmente ya no es posible visualizarla (Fig. 11: c). Sí se agrega tinta china al medios se puede observar alrededor de los ovocitos un halo claro, resultante de la presencia del material proveniente de la lisis de la membrana vitelina. Existe una correlación entre la concentración de espermatozoides y la actividad lítica. En nuestras condiciones de trabajo, se requieren alrededor de 1.10⁶ espermatozoides por mililitro para conseguir este efecto (Tabla 14 ).

   Es necesario aclarar que, en estas condiciones, la adición de espermatozoides a los ovocitos degangados no da lugar a la fecundación no observándose tampoco signos exteriores de activación, como ser la aparición del segundo polocito.

Efecto de la activación del ovocito sobre la acción lítica de los espermatozoides | a Contenidos

   Un punto muy importante de destacar es que la membrana vitelina de los ovocitos activados (o sea la membrana de fecundación ) no resulta atacada por los espermatozoides, tal como se observa en la Tabla 15 la membrana de los ovocitos de Bufo arenarum activado, por picadura con una aguja de vidrio, no son sensibles al ataque de las suspensiones de espermatozoides.

   Dado que en Bufo arenarum la activación del ovocito implica la ruptura de los gránulos corticales, es probable que este fenómeno este vinculado al cambio de susceptibilidad de la membrana frente a las lisinas espermáticas. Este cambio convertiría a la membrana vitelina en una barrera contra la polispermia, esto no excluye, por supuesto, que los cambios producidos a nivel de corteza puedan coadyuvar en este sentido.   Coincidentemente con nuestros resultados en Rana temporaria se observó que la membrana vitelina de los ovocitos activados se torna resistente al ataque por la tripsina y al tratamiento con ácido tioglicólico ().

   La lisis de la membrana vitelina no requiere la presencia de los espermatozoides. En efecto, el producto responsable de la lisis se libera al medio de incubación, ya que los sobrenadantes de 20.000 g de suspensiones de espermatozoides producen el mismo efecto sobre el ovocito que la presencia de los espermatozoides (Fig. 11, Tabla 16). Si relacionamos este hecho con las imágenes de la reacción acrosómica anteriormente descritas es de suponer que el producto que se detecta en los sobrenadantes corresponde al liberado por los espermatozoides durante la reacción acrosómica espontánea

Relación de la lisina con los espermatozoides | a Contenidos

   Dado que las suspensiones de espermatozoides fueron preparadas por homogeneización de testículos, fue necesario establecer si el producto responsable de la lisis estaba ligado a los espermatozoides o bien a otras estructuras celulares. Basados en el hecho que la lisina no se libera cuando la suspensión de espermatozoides se mantiene en fríos se desarrolló el esquema de la Tabla 17 . El mismo demuestra que la actividad está asociada a la presencia de los espermatozoides.

   Por otra partes si se eliminan los restos celulares que contaminan a las suspensiones de espermatozoides, por medio de centrifugación y lavado repetidos y luego se liofilizan los espermatozoides, cuando se resuspenden los mismos, los acrosomas aparecen rotos y la actividad lítica se detecta en la fase soluble.

Ausencia de especificidad de especie | a Contenidos

   Reacciones cruzadas entre ovocitos de Bufo arenarum y suspensiones de espermatozoides de otras especies de anfibios, mostraron la presencia de actividad lítica en la mayoría de los ensayos (Tabla 18). Se encontró que las suspensiones de espermatozoides de Bufo paracnemis , Leptodactylus bufonious , Leptodactylus chaquensis y Leptodactylus prognathus disuelven la membrana vitelina de los ovocitos de Bufo arenarum . Solo Phyllomedusa sauvagii , especie que se encuentra taxonómicamente alejada del genero Bufo, no presenta actividad lítica, pero su fecundación es de un tipo especial ya que ocurre fuera del agua. Esta experiencia demuestra únicamente la existencia de productos líticos en las suspensiones de otras especies de anfibios, lo que no implica necesariamente que los productos sean los mismos. En efecto, si se prueban extractos crudos de Leptodactylus chaquensis sobre es posible detectar actividad proteolítica mientras que esto no sucede con los obtenidos a partir de los espermatozoides de Bufo arenarum.

   Cuando se adicionan inhibidores de proteinasas al medio en el que se ensayan los extractos crudos de lisina de Bufo arenarum, se observa que los mismos inhiben en diferente grado el efecto lítico (Tabla 19). En este ensayo los inhibidores se encuentran en concentración suficientes para bloquear la actividad de la tripsina según puede observarse en la misma Tabla. En estas condiciones el mayor efecto inhibidor corresponde al , el Ovomucoide no presenta inhibición y el un efecto intermedio.

Algunas propiedades de la lisina de Bufo arenarum | a Contenidos

   La actividad lítica es sensible a la acción del calor y el producto activo precipita por el agregado de sulfato de amonio al 60 - 70 %. El precipitado da reacción positiva cuando se lo ensaya con los reactivos de Biuret, azul de bromofenól y nigrosina para proteínas ().
Cuando se corre extractos crudos de lisina en una columna de Sephadex G-200, la actividad se detecta con el volumen excluido, lo que indica que posee un peso molecular aparente mayor de 200.000 (Fig. 12).

   El producto activo se pega en ® DEAE - Sephadex y se eluye con NaCl alrededor de 120 mM (Fig. 13), la actividad lítica eluída es sensible al y en menor grado al , su actividad no es afectada por el Ovomucoide

Inhibición del efecto de la lisina por acción de la Concanavalina A | a Contenidos

   Las lectinas (, ) son un grupo de substancias, la mayor parte de ellas de origen vegetal, que presentan una serie de propiedades biológicas y químicas muy interesantes. Aglutinan eritrocitos, "ligan" azúcares específicamente y precipitan polisacáridos y glicoproteínas también de manera específica. Algunas de ellas son mitogénicas . Actualmente son muy utilizadas para investigar la arquitectura de las superficies celulares y los cambios que se producen en las células malignas. También son utilizadas para aislar constituyentes específicos de membranas.
   Recientemente se introdujo el uso de lectinas para estudiar algunos aspectos de la relación ovocito-espermatozoide en diversas especies (, , ).
   Cuando se pretratan ovocitos sin ganga de Bufo arenarum con concanavalina A ( lectina que se extrae de la Canavalia ensiforme ) y se los somete a la acción de las proteinasas acrosómicas, las mismas no afectan la membrana vitelina del ovocito ( Tabla 20 ). Este efecto es revertido por acción de alfa-metil-D-manósido , alfa-D-glucósido y membranas vitelinas sonicadas (Tabla 21).

   Para localizar el punto de acción de la concanavalina A, se recurrió a un método citoquímico.
La observación de los cortes al microscopio electrónico (Fig. 14) mostró que el producto de reacción se encuentra distribuido uniformemente en la porción externa de la membrana vitelina. Los cortes también revelaron que los gránulos corticales de los ovocitos se encuentran intactos, por lo que no puede argüirse que su efecto sea mediado a través del mecanismo preventivo de la polispermia. Los controles no pretratados con concanavalina A no presentan en cambio dicha reacción.

fig. 14: sección a través de la región periférica de un ovocito de cavidad condicionado de Bufo arenarum, tratado con concanavalina A (30 ug/ ml) Las secciones se examinaron sin tinción con un microscopio electrónico RCA EMU-4 (x 12.000). GC: gránulo cortical; M: microvellosidad; MV: membrana vitelina; MP: membrana plasmática; PR: producto de reacción.

   Cuando los ovocitos sin ganga son pretratados con concanavalina A se obtiene una inhibición de la fecundación (Tabla 22 ). Dado que los espermatozoides de Bufo arenarum son aglutinados por la concanavalina A , al igual que los de otras especies (), se tuvo especial cuidado para que la misma no quedase en el medio de inseminación. En estas condiciones son suficientes 10 ug/ml para obtener una inhibición significativa de la fecundación. Esta Inhibición llega al 100% cuando se utilizan concentraciones mayores.

   Cuando se utilizan ovocitos con ganga, se necesitan concentraciones mayores para bloquear la fecundación ( Tabla 23 ).

   Si el tratamiento con concanavalina A se realiza luego de la fecundación, en idénticas condiciones, no hay inhibición de la segmentación. Por lo tanto, el efecto de la misma se ejerce sobre algún punto del mecanismo de la fecundación.
   Al igual que en el caso de su efecto sobre la acción de la lisina, hemos tratado de determinar si en nuestras condiciones de trabajo, la inhibición producida por la concanavalina A estaba relacionada con su propiedad de unirse a ciertos carbohidratos. Si al medio de incubación de los ovocitos con concanavalina A se agregan los sacáridos que inhiben su acción () Se observa una disminución significativa del efecto inhibitorio de la concanavalina A (Tabla 24 ).

   Si al medio de incubación se agregan membranas vitelinas sonicadas, obtenidas a partir de ovocitos cavitarios, se consigue un efecto semejante (Tabla 24).
   Estos resultados coinciden con el efecto que ejerce esta lectina sobre la lisis. Si bien no se descarta un eventual efecto sobre otros puntos de la interacción ovocito-espermatozoide, nuestras experiencias nos permiten concluir que la concanavalina A inhibiría la fecundación impidiendo el ataque de la membrana vitelina por parte de las proteinasas acrosómicas.