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MATERIAL Y MÉTODOSContenidosGameto femenino | Ovocitos de ovisaco | Ovocitos de cavidad | Ovocitos de " pars recta " | Degangado | Aislamiento de membranas vitelinas | Gameto masculino
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Fig. 1 Ovocito de Leptodactylus chaquensis (x300) OV: ovocito; CG: capas de ganga. |
Por otra parte, el conjunto de ovocitos aparece rodeado de un material de consistencia viscosa. Si este material se suspende en agua o solución salina y se agita insuflando simultáneamente aire, es posible obtener en el laboratorio una espuma semejante
(Fig. 2 ) a la encontrada en los nidos naturales
(
,
).
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| Fig. 2: Nido de espuma de Leptodactylus chaquensis obtenido en el laboratorio. |
Para la obtención de ovocitos de la cavidad del cuerpo, las hembras se anestesiaron con éter y se ligaron sus oviductos a la altura del "ostium". Las mismas se dejaron recuperar durante 12 horas y luego se indujo la ovulación. Al cabo de 14-16 horas a 21 ± 2 °C o de 7- 9 horas a 25 ± 2 °C se procedió a sacrificar los animales.
Para la obtención de ovocitos de cavidad y de ovisaco a partir de un mismo ejemplar, hembras aclimatadas a 25 ± 2 °C fueron inducidas a ovular y se sacrificaron entre las 4 y 5 horas de iniciado el tratamiento.
Se obtuvieron de animales inducidos a ovular en la forma indicada en el punto anterior.
Dado que al sacrificar el animal los oviductos se encuentran llenos en toda su extensión, se procedió a ligar la porción comprendida entre el
ostium y la finalización de la pars recta para evitar que los movimientos peristálticos desplacen a los ovocitos. Luego se procedió a seccionar este segmento del oviducto y a transferirlo en solución de
Holtfreter (
). Cuando se eliminan las ligaduras, los ovocitos salen del conducto impulsados por las contracciones del oviducto. La observación al microscopio estereoscópico indicó que los mismos no poseían ganga.
Las tiras de ovocitos uterinos se hidrataron en Ringer
()
0,1 () durante 30 minutos y luego se sometieron a la acción del KCN al 1% o del tioglicólico (neutralizado) al 2%. En el primer caso las cubiertas se eliminan luego de 30-40 minutos, mientras que en el segundo se requieren aproximadamente 2 minutos. La eliminación de la totalidad de la ganga se controló bajo microscopio estereoscópico. Ambos tratamientos fueron seguidos por un abundante lavado con agua potable y Ringer (u Holtfreter), solución en la que se conservó los ovocitos hasta su posterior utilización.
Material utilizado
Ovocitos de cavidad de Bufo arenarum
Homogeneizador de Potter provisto de mango de teflón
Malla de nylon (cribas irregulares de aproximadamente 0,1-0,2
mm de lado)
Procedimiento
Los ovocitos se homogeneizaron con dos golpes de pistón y se filtraron inmediatamente por la malla (radio de la superficie filtrante: 3,5 cm) en corriente de agua destilada hasta que la observación visual indicó que la mayor parte de los restos de los ovocitos habían sido eliminados. Las membranas se pasaron a un vaso de precipitación haciendo correr agua destilada por el reverso de la malla. El lavado se repitió tantas veces como fue necesario para asegurar la eliminación de todos los restos de ovocitos. Las membranas limpias se pasaron a un vaso de precipitación, se dejaron sedimentar y finalmente se centrifugaron a 3.000 g.
Todas las operaciones se efectuaron en cámara fría a 4 °C.
Los animales se sacrificaron por destrucción medular. Los testículos fueron extraídos y las suspensiones de espermatozoides se obtuvieron por dilaceración de los mismos en la solución salina deseada, eliminándose los restos tisulares por filtración a través de gasa.
La concentración de los espermatozoides se determinó por recuento en cámara de
Neubauer o bien midiendo su densidad óptica a 550 nm con un espectrofotómetro
® Spectronic 20 de Bausch y Lomb.
[Arriba]
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) en el saco linfático dorsal de hembras aclimatadas (al menos por 12 horas) a 21 ± 2 °C. Entre 14 Y 16 horas de iniciado el tratamiento los animales se sacrificaron por destrucción medular. 
) en hembras mantenidas a 25 ± 2 °C. Entre 7 y 9 horas de iniciado el tratamiento los animales se sacrificaron por destrucción medular. En este caso los ovocitos no se presentan en cordones como los de Bufo arenarum , sino que individualmente y rodeados por dos capas de ganga por lo menos
(