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PRUEBAS EXPERIMENTALES Contenidos
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 | Gelatina de colágeno al 5%,  -HCl 10 mM, pH 7,6; CaCl2 1 mM |
| Solución de Ponceau |
|  ,
y Ovomucoide ( )
() |
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| Espermatozoides de Leptodactylus chaquensis o de Bufo arenarum |
| Micrómetro ocular calibrado |
Procedimiento
Trozos de testículo se dilaceraron en la solución de gelatina mantenida a 25-27 °C.
Alícuotas de esta suspensión se diluyeron hasta una concentración de 4 - 8.10 6 esp./ml. Gotas de esta suspensión se extendieron en portaobjetos y los extendidos se mantuvieron durante 2 minutos a 4 °C (para solidificar la gelatina) y luego se incubaron a 19 °C en cámara
húmeda. Se observaron a intervalos regulares en contraste de fases o previa tinción durante 2 minutos con solución de
Ponceau.
Dado que en este método, como en otros similares, los halos de reacción varían en diámetro de acuerdo a la región del preparado observado
(
), todas las observaciones se realizaron en los bordes de la preparación con el objeto de obtener resultados comparativos. La medición de los halos es realizó a los 30 minutos de incubación en extendidos coloreados con Ponceau para el caso de Leptodactylus chaquensis.
Cuando fue necesario se adicionó al sistema ,
y Ovomucoide en las concentraciones indicadas en las tablas.
Métodos bioquímicos
1) Se basa en la estimación del material sensible a la ninhidrina producido durante la hidrólisis enzimática de la gelatina de colágeno.
Reactivos
| Sustrato: Gelatina de colágeno al 5%;
-HCl 10 mM, pH 7,6; Ca Cl 2 1 mM. |
| Enzimas: Se preparó a partir de espermatozoides de Leptodactylus chaquensis procesados de acuerdo al método 3 de la preparación de crudos enzimáticos.
2,47 mg/ml de proteínas dosadas según Lowry ( ). |
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,
y Ovomucoide
(2 mg/ml, -HCl 50 mM, pH 7,6) |
| -ClH 50 mM pH 7,6 |
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al 20% |
Procedimiento
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Mezcla de incubación |
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|---|---|
| Producto | Cantidad |
| Gelatina al 5 %......0,100 ml | |
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Enzima...................0,050 ml |
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| .........................0,030 ml |
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, los tubos se centrifugaron a 1.000 g durante 30 minutos y la
actividad proteolítica fue estimada en base a la reacción a la ninhidrina, empleando el método de Moore
(
).
. El ensayo es una variante del método de Erlanger
(
) adaptado por nosotros para las microcubetas del espectrofotómetro
®Beckman (Modelo DB). Reactivos
Sustrato: 5 mg de
se disolvieron en 0,1 ml de 
y el volumen se ajustó a 10 ml por el agregado de -HCl 50 mM, pH 7,6 y se mantuvo a una temperatura mayor de 25 °C.
Otros materiales: Idem al método 1.
Procedimiento
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Mezcla de incubación |
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|---|---|
| Producto | Cantidad |
| ................................0,400 ml |
|
|
|
|
| Crudo enzimático...............0,050 ml | |
La cubeta correspondiente al blanco se cargó con una mezcla de
y a la que se agregó enzima inactivada. La cubeta correspondiente a la muestra problema, conteniendo
y , se colocó en posición de lectura en el espectrofotómetro y ambas se dejaron equilibrar durante 5 minutos (el portacubetas se termostatizó a 25 °C). La enzima se agregó al sustrato y luego de homogeneizar se llevó a 100% de transmisión. A partir de este momento se comenzó a leer con intervalos de 1 minuto. Las lecturas se realizaron a 410
nm.
Para ensayar los inhibidores se reemplazó al
por uno de los mismos.
Para probar el efecto del EDTA sobre la actividad del crudo enzimático se agregó el mismo a una
concentración final de 10 mM.
Método 1
Se basa en la estimación del porcentaje de ovocitos fecundados, resultante de la inseminación de ovocitos con ganga en presencia de los inhibidores.
Dado el peso molecular de los inhibidores, fue necesario averiguar si las sustancias de alto peso
molecular pueden atravesar las cubiertas de ganga. Para ello se colocaron tiran de ovocitos en una solución de azul dextran. La observación bajo microscopio estereoscópico, indicó que el colorante difunde hasta el ovocito en un lapso de 15 minutos aproximadamente.
Si las tiras se retiran de la solución y se colocan en Ringer 0,1 el colorante se mantiene dentro de la ganga luego de 24 horas. Por lo tanto y considerando únicamente su peso molecular, los inhibidores pueden penetrar a través de la ganga.
Material utilizado
| Tiras de ovocitos maduros de Bufo arenarum |
| Suspensión de espermatozoides de Bufo arenarum en
Ringer 0,1 -HCl 10 mM, pH 7,6 (1.106 esp./ml) |
| ,
, Ovomucoide disueltos en Ringer 0,1
-HCI 10 mM, pH 7,6 |
Procedimiento
Tiras de alrededor de 25 ovocitos se colocaron en cápsulas de plástico (Capacidad 0,5 ml) contenientes
0,150 ml de las diferentes concentraciones del inhibidor, al cabo de 30 minutos se inseminaron con
0,015 ml de la suspensión de espermatozoides. Como controles se utilizaron tiras colocadas en 0,150 ml de Ringer 0,1
-HCl 10 mM, pH 7,6.
La temperatura de trabajo fue de 25 ± 2 °C.
Método 2
Se basa en la estimación del porcentaje de ovocitos fecundados resultante de la inseminación de ovocitos sin ganga en presencia de inhibidores de
proteinasas.
Dado que el proceso de degangado puede afectar en mayor o menor grado la membrana vitelina del
ovocito, se utilizaron ovocitos de cavidad condicionados con homogenado de pars recta e inseminados en presencia de factor
difusible.
Material utilizado
| Ovocitos de cavidad maduros de Bufo arenarum , condicionados durante 15 minutos en homogenado de pars recta. |
| Suspensión de espermatozoides de Bufo arenarum , en Ringer 0,1
-HCl 10 mM, pH 7,6 (2.108 esp./ml). |
| Factor difusible |
| ,
, Ovomucoide, disueltos en Ringer 0,1 |
| -HCI 10 mM, pH 7,6. |
Procedimiento
Grupos de 20-30 ovocitos condicionados se lavaron con Ringer 0,1;
-HCl 10 mM, pH 7,6 y se colocaron en cápsulas de plástico (volumen total 0,5 ml) conteniendo 0,250 ml de factor difusible y 0,250 ml de Ringer 0,1
-HCl 10 mM, pH 7,6 (o la cantidad de inhibidor correspondiente). Los ovocitos se inseminaron con 0,015 ml de la suspensión de espermatozoides
Por condicionamiento debe entenderse el proceso que sufre el ovocito de cavidad por acción del homogenado de pars recta y que se estima en base al número de ovocitos fecundados luego de haber
sido sometidos a la acción del mismo.
Dado que la actividad de los homogenados varía en cada preparación fue necesario recurrir a una titulación empírica de los mismos. El procedimiento consiste básicamente en tratar
ovocitos de cavidad maduros con diluciones crecientes de homogenado durante un tiempo fijo (15 ó 30 minutos) y luego lavarlos con Holtfreter 0,1 o Ringer 0,1
-HCl 10 mM, pH 7,6.
La inseminación se realiza en un volumen fijo de la misma solución y a una concentración de espermatozoides determinada. En ciertos casos la inseminación se realizó en presencia de un medio que
contenía factor difusible al 50 %.
En cualquiera de los dos casos se elige la combinación que da el mayor porcentaje de fecundación con la
menor concentración de producto activo.
Por lo tanto, en todos, los experimentos en los cuales se utilizan ovocitos de cavidad condicionados debe entenderse que previo al experimento se realizó un dosaje, que permitió ajustar las condiciones experimentales a límites que aseguraron un alto porcentaje de fecundación.
Preparación del homogenado de pars recta
Ejemplares hembras de Bufo arenarum se anestesiaron con éter y luego se procedió a ligar los oviductos entre el ostium y la finalización de la pars recta (la definición topográfico e histoquímica de esta región ha sido precisada por Allende y Orías
(
)
y Moreno (
).
Los animales se dejaron reposar durante 12 horas a 21 ± 2 °C y luego se indujo la ovulación. Los animales se sacrificaron a las 12 horas por destrucción medular.
Se extrajo la pars recta únicamente de los animales que presentaban ovocitos en cavidad. Las secciones extraídas se homogeneizaron en un equipo Virtis, en un volumen variable de Holtfreter standart o Ringer
-HCl 10 mM, pH 7,6 y luego se centrifugaron a 5.000 g durante 15 minutos. El sobrenadante se dializó contra la solución de homogeneización (todas estas operaciones se realizaron a 4 °C). El producto se conservó congelado o bien liofilizado.
Factor difusible
Se preparó de acuerdo a la técnica de Barbieri y del Pino
(
) , realizando dos extracciones sucesivas de varios miles de ovocitos con ganga, no fecundados, con agua destilada (1/1,P/V, 10 minutos a 25 °C ) .
Como antígeno se utilizo homogenado de pars recta de Bufo arenarum en Holtfreter standart, obtenido a partir de animales cuya pars recta había sido previamente ligada y luego estimulados con hipófisis homóloga.
El extracto contenía 4 mg/ml de proteínas y las pruebas realizadas indicaron que era capaz de condicionar a los ovocitos de cavidad (con una dilución 1/50 del extracto en Holtfreter standart se obtuvo un 60% de ovocitos fecundados en las siguientes condiciones: ovocitos maduros obtenidos de la cavidad del cuerpo fueron incubados en la dilución mencionada durante 30 minutos. Los ovocitos se lavaron tres veces con 50 ml de Holtfreter 0,1 y se inseminaron. El medio de inseminación contenía 2,5 ml de Holtfreter 0,1 y al mismo se agregaron 0,5 ml de una suspensión de espermatozoides 1.108 esp./ml) ).
La inmunización se realizó inyectando 3 dosis de 1 ml c/u (mezclados V/V con coadyuvante de Freund) en cada conejo, con intervalos de 7 días.
La presencia de anticuerpos se verificó por el método de precipitación en tubo 10 días después de la 3ra. inyección. Se realizaron dos extracciones más a los 13 y 16 días de la misma (por punción
cardiaca ) tanto de animales tratados como de controles no inyectados. El suero se separó y se conservó liofilizado.
Efecto del suero anti pars recta en la fecundación
Grupos de 50-100 ovocitos maduros de Bufo arenarum , condicionados con homogenado de pars recta, se pusieron en contacto con una dilución 1/10 de suero anti pars recta o suero control por 2 horas, los ovocitos se lavaron con Holtfreter 0,1 y se inseminaron al igual que en el punto anterior.
Principio
Se basa en el hecho de que la molécula de concanavalina A se pega a las glicoproteínas de la superficie celular, dejando por razones
estéricas un sitio activo libre en su molécula. Este sitio puede ser conjugado con peroxidasa extraída de rábano rusticano, enzima que es esencialmente una glicoproteína. El producto de reacción de la diaminobencidina con el agua oxigenada, catalizada por la enzima, es lo que se detecta citoquímicamente
(
).
Material utilizado
| Ovocitos de cavidad maduros de Bufo arenarum condicionados con homogenado de pars recta |
| Concanavalina A disuelta en Ringer -HCl 10 mM, pH 7,6 |
| Peroxidasa, 30 ug/ml en Ringer -HCl 10 mM, pH 7,2 |
| Medio de revelado (concentraciones finales) | |
|---|---|
| Producto | Cantidad |
| Diaminobencidina ................. 0,5 mg/ml | |
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| Na Cl ........................................100 mM | |
| Agua oxigenada ......................0,01 % | |
Material de fijación
| Glutaraldehido al 6 % en buffer fosfato 100 mM pH 7,4 |
| Ácido ósmico al 1% |
Procedimiento
Los ovocitos de cavidad condicionados se colocaron en concanavalina A durante 30 minutos, se lavaron con Ringer
-HCl 10 mM, pH 7,6 y se incubaron con peroxidasa durante 15 minutos, se lavó nuevamente y se colocaron en el medio de revelado durante 15 minutos, se lavó y se fijó en glutaraldehido en frío durante 1 hora posfijándose en frío con ácido ósmico durante 12 horas.
Inclusión y cortes
El material se incluyó en Araldita ( 6005, Ladd). Los cortes se realizaron en un ultramicrótomo
® Porter Blum MTI.
[Arriba]
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).
) quienes usaron una mezcla de gelatina de colágeno con tinta china como sustrato. Fue modificada por Benitez-Bribiesca y Velázquez -Meza
(
) quienes eliminaron la tinta china del sistema, lo cual permite una mejor visualización de los detalles morfológicos. Esta técnica ligeramente modificada, fue utilizada por nosotros.