PRUEBAS EXPERIMENTALES

REACCIÓN ACROSOMICA Y FECUNDACIÓN

Fecundación en Leptodactylus chaquensis

Un punto que resultaba importante aclarar era la relación entre los cambios observados en el acrosoma

del espermatozoide de Leptodactylus chaquensis y la fecundación. Este anuro presentaba el inconveniente de que nada se conocía acerca de su fecundación en el laboratorio, ya que las especies del genero Leptodactylus sólo ocasionalmente han sido utilizadas en Embriología experimental, probablemente por tratarse de especies de ciclo sexual discontinuo, lo cual limita su utilización a sólo unas pocas semanas del año (39).

Una particularidad de Leptodactylus chaquensis es que depone sus ovocitos en nidos de espuma. Estos nidos los forma el macho agitando enérgicamente con las patas posteriores el producto viscoso que la

hembra elimina conjuntamente con los ovocitos durante el abrazo sexual (9). Por lo tanto previo al

estudio de la relación entre la reacción acrosómica y la fecundación fue necesario desarrollar un método para fecundar gametos obtenidos en el laboratorio y determinar algunos parámetros que afectan la viabilidad de los mismos.

El primer punto a determinar fue si la presencia de espuma era necesaria para la fecundación. La Tabla 6 muestra que la fecundación puede realizarse sin inconvenientes en ausencia de espuma. Sin embargo, los ovocitos fecundados en estas condiciones manifiestan anomalías en su desarrollo posterior (Fig. 9 ). Algunos ensayos complementarios mostraron que la restitución de la espuma después de la fecundación previenen estas anomalías, permitiendo un desarrollo normal.

Los huevos de Leptodactylus chaquensis , a diferencia de otras especies, requieren oxígeno durante los primeros estadios de desarrollo. En efecto cuando se los incuba en condiciones de estricta anaerobiosis, el desarrollo queda bloqueado en los primeros estadios de la segmentación (40). Es probable, por lo tanto, que las anomalías observadas cuando se mantienen los ovocitos en ausencia de espuma sean debidas a una deficiente oxigenación. De ser correcta esta hipótesis una de las principales funciones de la espuma, en esta especie, sería la de asegurar la oxigenación del huevo en desarrollo. Por otra parte la falta de efecto de la ausencia de espuma en la fecundación, concuerda con la observación de que es posible fecundar a los ovocitos en condiciones de estricta anaerobiosis. (40) .

Respecto al manejo de los gametos, cabe agregar que la viabilidad de los ovocitos en solución salina cae a medida que aumenta su tiempo de permanencia en la misma ( Tabla 7 ). Otro tanto se observa en el caso de los espermatozoides ( Tabla 8 ).

Correlación entre estado del acrosoma y fecundación.

Para este estudio nos hemos basado en el hecho ya mencionado de que el estado del acrosoma depende del medio en el que se hallan suspendidos los espermatozoides. La prueba consistió en inseminar ovocitos con espermatozoides provenientes de distintos medios, controlando la morfología del acrosoma, y la proporción de ovocitos fecundados.

Los datos de la Tabla 9 muestran una correlación directa significativa entre el porcentaje de espermatozoides en fase 1 y el porcentaje de ovocitos fecundados (r: 0,998, p< 0,001).Este dato nos indica que para obtener altos porcentajes de fecundación es necesario partir de suspensiones de espermatozoides en las que no haya tenido lugar una reacción acrosómica espontánea. Quedaba por establecer, sin embargo, si los cambios en el acrosoma son necesarios para que el espermatozoide pueda penetrar las cubiertas de ganga que rodean al ovocito. Las observaciones directas y los registros cinefotográficos efectuados (35) mostraron que los espermatozoides pueden cumplir su tránsito a través Los resultados anteriormente expuestos indican que la capacidad fecundante de los espermatozoides de las cubiertas de ganga manteniendo intacto su acrosoma (Fig. 10 ).

Los resultados anteriormente expuestos indican que la capacidad fecundante de los espermatozoides de Leptodactylus chaquensis se mantiene en tanto no se produzca la reacción acrosómica espontánea. Según hemos visto, el hecho de que la misma se produzca o no, parece depende de la tonicidad de las soluciones en que se suspenden los espermatozoides. La capacidad de ciertas soluciones para preservar la viabilidad de los espermatozoides ha sido reconocida también en otras especies de anfibios. En Xenopus laevis ( 41 ) este efecto fue denominado "capacitación artificial". Sin embargo creemos que este termino no resulta adecuado ya que capacitación tal como se emplea este termino para los mamíferos ( 42 ) , implica cambios en el espermatozoide que hacen posible la reacción acrosómica y la fecundación. Nuestros resultados más bien indican que se trataría de un efecto osmótico capaz de estabilizar las membranas del acrosoma previniendo de esta manera la ocurrencia de una reacción prematura.

El hecho de que no son necesarios cambios en el acrosoma del espermatozoide para atravesar las cubiertas de ganga, indican que el contenido del acrosoma seria utilizado a otro nivel, lo que será considerado en una sección aparte.

ACCIÓN DE LOS INHIBIDORES DE LA TRIPSINA SOBRE LA FECUNDACIÓN

Los datos presentados hasta aquí, permiten suponer que en el mecanismo de penetración de los espermatozoides intervienen proteinasas acrosómicas y que las mismas no son utilizadas para atravesar la ganga.

Con el objeto de explorar la validez de las presunciones que se desprenden de las observaciones anteriores, se utilizaron inhibidores de proteinasas. Los mismos fueron ensayados en dos sistemas experimentales uno de ellos utiliza ovocitos con ganga y el otro ovocitos sin ganga adicionados de los factores que hacen posible su fecundación ( Cf. Material y Métodos). Para este tipo de experiencias resultó mas adecuado trabajar con los ovocitos y espermatozoides de Bufo arenarum , los resultados obtenidos muestran que cuando los inhibidores se encuentran presentes en el medio de inseminación, se observa una disminución significativa en el porcentaje de fecundación. El grado de inhibición depende de la presencia o no de ganga y del tipo de inhibidor utilizado. Entre ellos el SBTI parece ser el mas efectivo ( Tabla 10 ). A una concentración de 1 mg/ml los porcentajes de fecundación

caen hasta alrededor de un 10% utilizando ovocitos con ganga, mientras que en el sistema sin ganga se consigue igual efecto con solo 0,01 mg /ml. El ovomucoido no parece afectar la fecundación de los ovocitos con ganga aún a concentraciones tan altas como 10 mg/ml, mientras que en el otro sistema muestra un moderado efecto inhibitorio (Tabla 11). El LBTI mostró un efecto intermedio en ambos sistemas ( Tabla 12 ). La diferencia de efectividad de los distintos inhibidores para bloquear la fecundación, puede explicarse en razón de su diferente capacidad inhibitoria sobre enzimas proteolíticas (Cf. Material y Métodos). Por otra parte, la diferencia de efectividad de un mismo inhibidor en los dos sistemas utilizados, puede ser debida a una variación de la concentración efectiva del mismo por la presencia o no de la ganga.

Con el objeto de descartar una acción eventual del inhibidor no relacionada con la fecundación, se trataron ovocitos ya fecundados con cada inhibidor en la mayor concentración utilizada. No se observó inhibición de la segmentación en ninguno de los sistemas utilizados.

Observaciones realizadas adicionando inhibidores a las suspensiones de espermatozoides indicaron que la motilidad de los mismos se mantenía. Cabe destacar además que el examen de las tiras, luego de inseminarlas, indicó que en todos los casos los espermatozoides llegaron a la membrana vitelina.

Estos experimentos concuerdan con observaciones efectuadas en otras especies de anfibios (25, 43 ) y refuerzan la idea de que las proteinasas acrosómicas se encuentran relacionadas con el proceso de singamia.

ATAQUE A LA MEMBRANA VITELINA POR LOS ESPERMATOZOIDES

Como ya fuera mencionado cuando el ovocito de anfibio es liberado del ovario se halla rodeado por una cubierta extracelular llamada "membrana vitelina". La estructura de esta membrana, poco conocida todavía, no corresponde a la de una membrana plasmática. Otros nombres utilizados para designar a esta misma envoltura son : membrana ovocitaria, cubierta vitelina, involucro vitelino y corión, reservados generalmente para invertebrados y vertebrados inferiores. La estructura correspondiente de los mamíferos recibe el nombre de zona pelúcida o membrana pelúcida. Provisoriamente es preferible mantener la denominación de membrana vitelina para designar esta capa que según lo señala Wischnitzer (44), rodea al ovocito en el período comprendido entre la ovulación y la fecundación. Sin embargo creemos que en el futuro será necesario reveer esta denominación, dado que el caracterizar a esta membrana como "vitelina" lleva a confusión debido a que este termino se asocia fácilmente con el material de reserva del ovocito, llamado vitelo y, por otra parte, según lo señala Wolf (45 ), no sería ni siquiera correcto denominarla membrana.

Existen pocos datos bibliográficos acerca de la naturaleza de este involucro. Se origina probablemente como resultado de una interacción de las células foliculares y el ovocito durante la ovogénesis (44). Es sensible a las enzimas proteolíticas (46 , 47 ) y a los agentes reductores de S-S (48). En Xenopus laevis se han identificado algunos componentes macromoleculares por filtración en gel y electroforesis (49 , 50 ). En nuestro laboratorio hemos comprobado recientemente que resulta fácilmente soluble en ácido y álcalis.

En el ovocito no fecundado de los anfibios anuros, la membrana vitelina se encuentra externamente a la plasmática y entre ambas sólo existe un pequeño espacio perivitelino. En el momento de la fecundación, o de la activación del ovocito, los gránulos corticales se rompen, el espacio perivitelino aumenta y en la membrana se producen cambios, que unidos a los que sufrió el cortex, hacen que el ovocito se torne refractario a la penetración por otro espermatozoide (51 , 52 , 53 ). Este proceso se conoce como reacción preventiva de la polispermia y la membrana vitelina pasa a llamarse membrana o involucro de fecundación. Luego de este proceso, el ovocito rota y al cabo de cierto tiempo se puede apreciar en el polo animal del mismo, la salida del segundo polocito.

En Xenopus laevis se han aportado datos que indican que el material de los gránulos corticales forma una nueva capa en la superficie externa de la membrana vitelina como resultado de la activación (54 , 55 , 56 ). En vertebrados y en mamíferos el mecanismo de formación de la membrana de fecundación parece ser mediado a través de proteinasas liberadas por los gránulos corticales (57 , 58 , 59 , 60 ).

En Bufo arenarum sabemos que existen gránulos corticales y que, al igual que en otros anuros los mismos se rompen en el momento de la activación (61 ). Sin embargo no hemos encontrado hasta el presente evidencias que indiquen la existencia de una capa adicional en la membrana de fecundación.

Enzimas encontradas en extractos de espermatozoides de numerosas especies de invertebrados y vertebrados poseen la propiedad de atacar la membrana vitelina del ovocito (o sus análogos) y son conocidas genéricamente con el nombre de lisinas espermáticas o espermatolisinas (23). La existencia de estas enzimas juega un papel clave en la fecundación, ya que su intervención es generalmente necesaria para que los espermatozoides puedan atravesar la barrera constituida por la envoltura del ovocito.

A pesar de haberse señalado la presencia de un gran número de enzimas asociadas al acrosoma del espermatozoide de distintas especies (62 , 63 , 64 , 65 , 66 , 67 , 68 , 69 , 70 , 71 , 72 , 73 ), en la mayor parte de los casos no se ha de mostrado su relación directa con la fecundación. En los últimos años, se obtuvieron evidencias de que una enzima semejante a la tripsina, presente en el acrosoma de los espermatozoides de mamíferos (23), intervendría realmente en la penetración del mismo a través de la zona pelúcida. En aves también se señaló a este mismo tipo de enzimas (73) como responsables de la penetración del espermatozoide a través de la membrana vitelina del ovocito.

En anfibios hemos descrito que en los espermatozoides de Leptodactylus chaquensis y Bufo arenarum el contenido del acrosoma está compuesto, por lo menos en parte, por proteinasas acrosómicas y nuestros resultados, coincidentes con los obtenidos en Rana pipiens (25, 43), aportan evidencias indicativas de que también en estos vertebrados intervendrían en la penetración del espermatozoide.

Efectos líticos de las suspensiones de espermatozoides sobre la membrana vitelina de ovocitos degangados

Independientemente del método utilizado para eliminar los involucros gelatinosos, la membrana vitelina de los ovocitos de Bufo arenarum es atacada por las suspensiones de espermatozoides (Tabla 13 ). El ataque de la membrana vitelina puede observarse claramente bajo microscopio estereoscópico. La secuencia típica del fenómeno ( a 22 °C, ovocitos degangados en KCN ) es la siguiente : aproximadamente 10 minutos después de la adición de los espermatozoide a los ovocitos, la primera reacción que se observa es a nivel del cortex ovocitario. En el mismo se forman pequeñas depresiones que finalmente coalescen dando a la superficie del ovocito un aspecto muy irregular (Fig. 11: b ). A los pocos minutos de iniciado el tratamiento tiene lugar un marcado descenso de la tensión del ovocito. Esto puede ser apreciado fácilmente ejerciendo una ligera presión sobre el mismo por medio de un ansa de cabello, poco tiempo después, el ovocito se colapsa, momento en el que la membrana vitelina puede ser separada con relativa facilidad.

Luego de una hora, la membrana aparece engrosada y el ataque sobre ella prosigue hasta que, finalmente ya no es posible visualizarla (Fig. 11: c). Sí se agrega tinta china al medios se puede observar alrededor de los ovocitos un halo claro, resultante de la presencia del material proveniente de la lisis de la membrana vitelina. Existe una correlación entre la concentración de espermatozoides y la actividad lítica. En nuestras condiciones de trabajo, se requieren alrededor de 1.10⁶ espermatozoides por mililitro para conseguir este efecto (Tabla 14 ).

Es necesario aclarar que, en estas condiciones, la adición de espermatozoides a los ovocitos degangados no da lugar a la fecundación no observándose tampoco signos exteriores de activación, como ser la aparición del segundo polocito.

Efecto de la activación del ovocito sobre la acción lítica de los espermatozoides

Un punto muy importante de destacar es que la membrana vitelina de los ovocitos activados ( o sea la membrana de fecundación ) no resulta atacada por los espermatozoides, tal como se observa en la Tabla 15 la membrana de los ovocitos de Bufo arenarum activado, por picadura con una aguja de vidrio, no son sensibles al ataque de las suspensiones de espermatozoides.

Dado que en Bufo arenarum la activación del ovocito implica la ruptura de los gránulos corticales, es probable que este fenómeno este vinculado al cambio de susceptibilidad de la membrana frente a las lisinas espermáticas. Este cambio convertiría a la membrana vitelina en una barrera contra la polispermia, esto no excluye, por supuesto, que los cambios producidos a nivel de corteza puedan coadyuvar en este sentido. Coincidentemente con nuestros resultados en Rana temporaria se observó que la membrana vitelina de los ovocitos activados se torna resistente al ataque por la tripsina y al tratamiento con ácido tioglicólico (74 ).

La lisis de la membrana vitelina no requiere la presencia de los espermatozoides. En efecto, el producto responsable de la lisis se libera al medio de incubación, ya que los sobrenadantes de 20.000 g de suspensiones de espermatozoides producen el mismo efecto sobre el ovocito que la presencia de los espermatozoides (Fig. 11, Tabla 16 ). Si relacionamos este hecho con las imágenes de la reacción acrosómica anteriormente descritas es de suponer que el producto que se detecta en los sobrenadantes corresponde al liberado por los espermatozoides durante la reacción acrosómica espontanea

Relación de la lisina con los espermatozoides

Dado que las suspensiones de espermatozoides fueron preparadas por homogeneización de testículos, fue necesario establecer si el producto responsable de la lisis estaba ligado a los espermatozoides o bien a otras estructuras celulares. Basados en el hecho que la lisina no se libera cuando la suspensión de espermatozoides se mantiene en fríos se desarrolló el esquema de la Tabla 17 . El mismo demuestra que la actividad está asociada a la presencia de los espermatozoides.

Por otra partes si se eliminan los restos celulares que contaminan a las suspensiones de espermatozoides, por medio de centrifugación y lavado repetidos y luego se liofilizan los espermatozoides, cuando se resuspenden los mismos, los acrosomas aparecen rotos y la actividad lítica se detecta en la fase soluble.

Ausencia de especificidad de especie

Reacciones cruzadas entre ovocitos de Bufo arenarum y suspensiones de espermatozoides de otras especies de anfibios, mostraron la presencia de actividad lítica en la mayoría de los ensayos ( Tabla 18 ). Se encontró que las suspensiones de espermatozoides de Bufo paracnemis , Leptodactylus bufonious , Leptodactylus chaquensis y Leptodactylus prognathus disuelven la membrana vitelina de los ovocitos de Bufo arenarum . Solo Phyllomedusa sauvagii , especie que se encuentra taxonómicamente alejada del genero Bufo, no presenta actividad lítica, pero su fecundación es de un tipo especial ya que ocurre fuera del agua. Esta experiencia demuestra únicamente la existencia de productos líticos en las suspensiones de otras especies de anfibios, lo que no implica necesariamente que los productos sean los mismos. En efecto, si se prueban extractos crudos de Leptodactylus chaquensis sobre BAPNA es posible detectar actividad proteolítica mientras que esto no sucede con los obtenidos a partir de los espermatozoides de Bufo arenarum .

Cuando se adicionan inhibidores de proteinasas al medio en el que se ensayan los extractos crudos de lisina de Bufo arenarum , se observa que los mismos inhiben en diferente grado el efecto lítico ( Tabla 19 ). En este ensayo los inhibidores se encuentran en concentración suficientes para bloquear la actividad de la tripsina según puede observarse en la misma Tabla.

En estas condiciones el mayor efecto inhibidor corresponde al SBTI, el ovomucoide no presenta inhibición y el LBTI un efecto intermedio

Algunas propiedades de la lisina de Bufo arenarum

La actividad lítica es sensible a la acción del calor y el producto activo precipita por el agregado de sulfato de amonio al 60 - 70 %. El precipitado da reacción positiva cuando se lo ensaya con los reactivos de Biuret, azul de bromofenól y nigrosina para proteínas (1).

Cuando se corre extractos crudos de lisina en una columna de Sephadex G-200, la actividad se detecta con el volumen excluido, lo que indica que posee un peso molecular aparente mayor de 200.000 (Fig. 12).

El producto activo se pega en DEAE - Sephadex y se eluye con NaCl alrededor de 120 mM (Fig. 13), la actividad lítica eluída es sensible al SBTI y en menor grado al LBTI, su actividad no es afectada por el ovomucoide.

Las lectinas (75 , 76 ) son un grupo de substancias, la mayor parte de ellas de origen vegetal, que presentan una serie de propiedades biológicas y químicas muy interesantes. Aglutinan eritrocitos, "ligan" azúcares específicamente y precipitan polisacáridos y glicoproteínas también de manera específica. Algunas de ellas son mitogénicas . Actualmente son muy utilizadas para investigar la arquitectura de las superficies celulares y los cambios que se producen en las células malignas. También son utilizadas para aislar constituyentes específicos de membranas.

Recientemente se introdujo el uso de lectinas para estudiar algunos aspectos de la relación ovocito-espermatozoide en diversas especies (77 , 78 , 79).

Para localizar el punto de acción de la concanavalina A, se recurrió a un método citoquímico (Cf. Material y métodos).

La observación de los cortes al microscopio electrónico (Fig. 14) mostró que el producto de reacción se encuentra distribuido uniformemente en la porción externa de la membrana vitelina. Los cortes también revelaron que los gránulos corticales de los ovocitos se encuentran intactos, por lo que no puede argüirse que su efecto sea mediado a través del mecanismo preventivo de la polispermia. Los controles no pretratados con concanavalina A no presentan en cambio dicha reacción.

Cuando los ovocitos sin ganga son pretratados con concanavalina A se obtiene una inhibición de la fecundación (Tabla 22 ). Dado que los espermatozoides de Bufo arenarum son aglutinados por la concanavalina A , al igual que los de otras especies (80 ), se tuvo especial cuidado para que la misma no quedase en el medio de inseminación. En estas condiciones son suficientes ug/ml para obtener una inhibición significativa de la fecundación. Esta Inhibición llega al 100% cuando se utilizan concentraciones mayores.

Cuando se utilizan ovocitos con ganga, se necesitan concentraciones mayores para bloquear la fecundación ( Tabla 23 ).

Si el tratamiento con concanavalina A se realiza luego de la fecundación, en idénticas condiciones, no hay inhibición de la segmentación. Por lo tanto, el efecto de la misma se ejerce sobre algún punto del mecanismo de la fecundación.

Al igual que en el caso de su efecto sobre la acción de la lisina, hemos tratado de determinar si en nuestras condiciones de trabajo, la inhibición producida por la concanavalina A estaba relacionada con su propiedad de unirse a ciertos carbohidratos. Si al medio de incubación de los ovocitos con concanavalina A se agregan los sacáridos que inhiben su acción (75) Se observa una disminución significativa del efecto inhibitorio de la concanavalina A (Tabla 24 ).

Si al medio de incubación se agregan membranas vitelinas sonicadas, obtenidas a partir de ovocitos cavitarios, se consigue un efecto semejante (Tabla 24).

Estos resultados coinciden con el efecto que ejerce esta lectina sobre la lisis. Si bien no se descarta un eventual efecto sobre otros puntos de la interacción ovocito-espermatozoide, nuestras experiencias nos permiten concluir que la concanavalina A inhibiría la fecundación impidiendo el ataque de la membrana vitelina por parte de las proteinasas acrosómicas.

SECRECIONES DEL OVIDUCTO Y ACCIÓN DE LAS PROTEINASAS: SU RELACIÓN CON LA FECUNDACIÓN

Es un hecho bien conocido en Embriología experimental que los ovocitos de anfibios desprovistos de su ganga no se fecundan cuando se inseminan en condiciones normales ( 81 , 82 , 83 , 84 , 85 , 86 , 87 , 88 , 89, 90 , 91 , 92 ).

En realidad cuando se habla de ovocitos sin ganga es necesario distinguir dos tipos distintos. El primero, corresponde a aquellos a los cuales se ha quitado artificialmente su ganga por medio de diferentes métodos ( tratamiento con cianuro de sodio, tioglicolato de sodio, irradiación ultra violeta, etc ) y se conocen como degangados. El segundo, corresponde a los ovocitos tomados de la cavidad celómica y que carecen de ganga por no haber pasado a través del oviducto.

Los ovocitos degangados han sido fecundados en una gran variedad de condiciones experimentales (85, 89, 91, 92, 93, 94, 95, 96 ) la mayor parte de ellas basadas en la inseminación en presencia de diversos productos provenientes de la ganga, lo que indica claramente la importancia de algunos de sus componentes moleculares para la fecundación (97, 98, 99,100).

En nuestro laboratorio hemos conseguido fecundar ovocitos degangados, inseminando a los mismos en presencia de altas concentraciones de espermatozoides (96), sin necesidad de adicionar ningún tipo de producto al medio. Es posible que este tipo de inseminación haya tenido éxito debido a la exacerbación de un mecanismo normal de la fecundación. En efecto, si normalmente el espermatozoide utiliza sus proteinasas acrosómicas para franquear la barrera que representa la membrana vitelina, es probable que en presencia de altas concentraciones de espermatozoides la gran cantidad de proteinasas liberadas por reacciones acrosómicas espontáneas haya modificado la barrera de la membrana y permitido por lo tanto la fecundación.

En contraste con las experiencias realizadas con ovocitos degangados, no ha sido posible obtener, en las mismas condiciones, altos porcentajes de fecundación con ovocitos de cavidad (88, 91,92)

En Rana pipiens se ha señalado que utilizando espermatozoides que estuvieron en contacto con ovocitos con gelatina es posible producir fenómenos de activación en ovocitos de cavidad, pero la interpretación de estos resultados es bastante difícil ya que los ovocitos no progresan en su desarrollo

(90).

En nuestro laboratorio, hemos logrado, en algunas oportunidades, fecundar ovocitos de cavidad utilizado altas concentraciones de espermatozoides y en Rana pípiens ocasionalmente se obtuvo este mismo resultado utilizando agua de huevos y altas concentraciones de espermatozoides (101 ).

También en Rana pipiens se obtuvo fecundación de ovocitos de cavidad alterando la membrana vitelina con agentes tales como el NaCN y la tripsina o bien utilizando espermatozoides heterólogos (101, 102 ). Por otra partes en Bufo bufo la eliminación de la membrana vitelina con pronasa permite obtener altos porcentajes de fecundación ( 103 ).

Resumiendo, en aquellos casos en los que se obtuvo fecundación de ovocitos de cavidad se necesitó alterar de una u otra forma la barrera representada por la membrana vitelina, por lo tanto uno de los factores que condiciona la penetración del espermatozoide es el estado en que se encuentra la misma. Resulta particularmente interesante que con altas concentraciones de espermatozoides (lo cual implica presencia de gran cantidad de proteinasas acrosómicas en el medio) o mediante el pretratamiento con tripsina, se logra fecundar a los ovocitos de cavidad.

Es posible, por lo tanto, que uno de los factores claves en la fecundación sea la diferente susceptibilidad de la membrana vitelina a las proteinasas acrosómicas.

Dado que la diferente respuesta de los ovocitos degangados y de cavidad a la inseminación se corresponde con el hecho que los últimos no pasaron a través del oviducto, esta susceptibilidad estaría conferida en ultima instancia por las secreciones del conducto femenino. Esta hipótesis propuesta por diversos autores (86, 102, 103, 104 , 105 ) ha sido sometida al control experimental en nuestro laboratorio.

De resultar correcta, posibilitaría la fecundación de los ovocitos de cavidad en condiciones similares a los ovocitos degangados. En este sentido es oportuno citar literalmente lo expresado por Rugh ( 106 ) : Si resultase posible la fecundación de ovocitos de cavidad y se lograse el desarrollo normal de los mismos sin gelatina, este hecho será un "boom" para la Embriología experimental...

Antes de intentar fecundar a los ovocitos de cavidad en base a esta hipótesis fue necesario, obviamente, controlar el estado de maduración nuclear de los mismos.

Dado que bajo este termino se ha descrito una amplia gama de procesos, es necesario precisar que en este caso se empleará para señalar los fenómenos que ocurren desde la ovogénesis a termino ( ovocitos en profase de la primera división meiótica ) hasta que expulsan el primer glóbulo polar y se detienen en la metafase de la segunda división meiótica (105).

Es sabido, que por acción de las hormonas hipofisarias que actúan a través de un mediador químico segregado por las células foliculares ( probablemente progesterona o un esteroide muy semejante ), el ovocito rompe su vesícula germinal ( núcleo en profase de la primera división meiótica ) y reinicia los procesos nucleares que lo llevan a la metafase de la segunda división, punto en el cual el proceso se bloquea nuevamente hasta la entrada del espermatozoide (107 , 108,109 , 110 , 111 , 112 , 113 , 114 ).

Paralelamente, ocurren una serie de cambios estructurales y fisiológicos que posibilitan el futuro desarrollo del embrión (105). Dado que todos estos cambios se inician por acción de la estimulación hipofisaria, el hecho de que un ovocito se encuentre en el estadio correcto de maduración es función del tiempo transcurrido desde la iniciación de dicho estímulo.

Para este tipo de experiencias, Bufo arenarum provee un material muy conveniente. Animales inyectados con suspensión hipofisaria y mantenidos a temperatura adecuada permiten la obtención de ovocitos tanto a nivel del ovisaco como de la cavidad del cuerpo en un mismo ejemplar.

La observación de las imágenes morfológicas que caracterizan a los diferentes estadios de maduración indicó que para un tiempo dado las mismas eran similares, independientemente de que los ovocitos se encuentren en la cavidad o en ovisaco (Fíg. 15). En ambos casos los ovocitos mantenidos "in vitro" llegan hasta la metafase de la segunda división meiótica (Fig. 15: b y d).

Inseminaciones sucesivas de ovocitos uterinos mostraron que, considerando como punto inicial el momento de la inyección hipofisaria, el resultado obtenido variaba con el tiempo. Para tiempos muy cortos la mayoría de los ovocitos no presentan signos externos de activación, es decir que no rotan, ni la membrana vitelina se separa de la superficie del ovocito. A medida que transcurre el tiempo se observa que los ovocitos rotan pero la mayor parte de ellos no segmenta.

Más adelante los ovocitos rotan y segmentos aunque muchos de ellos no llegan al periodo de gastrulación. Finalmente, luego de transcurridas mas de 6 horas 30 minutos, el 100% de los ovocitos consigue superar esta etapa. La Tabla 25 muestra como van apareciendo estos fenómenos en una experiencia tipo. La Fig. 16 muestra el aumento de los porcentajes de ovocitos fecundados a medida que transcurre el tiempo desde la inyección hipofisaria.

La observación de la morfología externa de los ovocitos indica que entre las 4 horas 30 minutos y 5 horas, la mayor parte de ellos muestran en el polo animal una zona depigmentada en el centro (Fig. 14: a y c) en la cual es posible observar a veces la mancha oscura que corresponde al huso de la primera división meiótica. Entre las 5 y 5.30 horas, en la mayor parte de ellos se reduce el área depigmentada y en el centro de la misma aparece la fosa por donde saldrá el primer polocito. Mas allá de las 6 horas la mayoría ya expulsó el primer glóbulo polar (Fig. 15, b y d).

Nuestros resultados establecen una relación estrecha entre el tiempo que transcurre desde la inyección hipofisaria y las etapas alcanzadas por los ovocitos uterinos. Este tiempo es necesario para que actúe sobre el protoplasma el material vertido desde la vesícula germinal y se produzcan, las modificaciones fisiológicas y estructurales que habilitarán al ovocito para su desarrollo.

Los resultados obtenidos son coincidentes con los de otros autores en el sentido de que es necesario que transcurra un determinado tiempo para que el ovocito este en condiciones de ser fecundado (115), la única variación que existe es que este tiempo cambia en las diferentes especies de anfibios.

Un punto importante de señalar, es que cuando se somete a la acción de las proteinasas acrosómicas ovocitos degangados y de cavidad, el efecto sobre la membrana vitelina de los primeros es mucho mayor que sobre la de los segundos. En efecto, las proteinasas acrosómicas actúan tardíamente sobre la membrana vitelina de los ovocitos de cavidad. La Fig. 17.a muestra cuatro ovocitos: dos degangados y dos de cavidad, el aspecto externo es semejante. Sin embargo, luego de agregarse espermatozoides al medio puede observarse que las membranas de los ovocitos degangados sufren un claro efecto lítico, mientras que las de los de cavidad muestran escasas señales de ataque (Fig. 17 : b y c). Este hecho confirma parte de la hipótesis enunciada, es decir la diferencia de susceptibilidad entre las membranas vitelinas de los ovocitos de cavidad y los uterinos. Sin embargo, el hecho de que para degangar ovocitos es necesario utilizar productos tales como el KCN o tioglicolato, cuyo efecto sobre la membrana ha sido señalado plantea la posibilidad de un artificio en estos resultados.

La primera porción del oviducto de Bufo arenarum , denominada pars recta no produce ganga, sino que en ella se acumula una secreción líquida. Esta porción representa la única parte del oviducto en la cual la membrana vitelina del ovocito se pone en contacto directo con las secreciones del mismo y, además, la única, a partir de la cual pueden obtenerse ovocitos sin ganga, sin necesidad de recurrir a ningún tratamiento químico. Resultaba por lo tanto, la porción ideal para comprobar la validez de los resultados anteriores.

Ensayando el efecto de las proteinasas acrosómicas sobre los ovocitos de esta porción de oviducto se observó que entre ellos y los de cavidad existían las mismas diferencias que entre los degangados y los de cavidad respecto a la sensibilidad a las proteinasas, es decir los ovocitos de pars recta son rápidamente atacados por las mismas.

Efecto del homogenado de pars recta

El pretratamiento de ovocitos de cavidad con homogenados de pars recta obtenidos a partir de animales estimulados con hipófisis condiciona a los mismos para que al ser tratados con proteinasas acrosómicas sus membranas sean atacadas rápidamente.

Fecundación de ovocitos de pars recta

Si se inseminan ovocitos tomados de la pars recta y de la cavidad del cuerpo en las condiciones señaladas en la Tabla 26 , los resultados indican que los ovocitos de la pars recta se fecundan en porcentajes significativamente superiores a los tomados de la cavidad del cuerpo.

Fecundación de ovocitos de cavidad pretratados con pars recta

El pretratamiento de ovocitos de cavidad por medio de homogenado de pars recta preparado a partir de animales tratados con hipófisis, condiciona a los mismos para que al ser inseminados se obtengan altos porcentajes de fecundación ( Tabla 27 ). Por el contrario cuando el pretratamiento se realiza con oviductos no estimulados este efecto no se observa.

Durante las experiencias se realizaron análisis cariológicos de gástrulas ( obtenidas al azar ). Las mismas mostraron cariotipo normal. Por otra parte tomando las debidas precauciones, el desarrollo se prolonga hasta la metamorfosis.

La única diferencia apreciable entre la inseminación de los ovocitos condicionados con pars recta y los ovocitos con ganga, es un retardo en la aparición del primer surco.

Esta diferencia puede ser explicada en base al retardo en la velocidad de fecundación (Fig. 18) ya que algunos datos obtenidos indican que los valores son bastante diferentes de los con ganga ( 116 ).

El factor responsable del efecto biológico sobre los ovocitos es termolábil ( Tabla 28 ) y no dializable.

Localización del factor pars recta

Si con las técnicas inmunológicas corrientes se preparan anticuerpos contra homogenados de pars

recta , los anticuerpos generados inhiben el efecto de dicho homogenado sobre los ovocitos. En efecto, tal como se puede observar en la Tabla 28, si ovocitos previamente condicionados con pars recta son

tratados con suero anti pars recta se observa una significativa inhibición de los porcentajes de

fecundación. Los controles realizados con suero de animales no tratados no presentaron

inhibición. Por otra parte, el tratamiento de los ovocitos cavitarios con homogenados de pars recta

conjugados con isotiocianato de fluoresceína permitió localizar la fluorescencia en la membrana vitelina ( 117 ).

El conjunto de las observaciones descritas en esta sección nos induce a suponer que la modificación de la membrana vitelina o su "maduración" por los factores del oviducto ( para emplear el termino acuñado por Schuetz ) es uno de los pasos que sigue el ovocito para asegurar se fecundación . Poco conocemos acerca del mecanismo de acción de este factor, las evidencias con anticuerpos y homogenado marcado indican que el mismo se pega a la membrana vitelina pero desconocemos todavía si un mecanismo enzimático está envuelto en este proceso.

CONCLUSIONES

Los resultados presentados muestran:

a) La existencia de una reacción acrosómica en los espermatozoides de los anfibios anuros.

b) La liberación de proteinasas (lisinas espermáticas) por parte del acrosoma.

c) La acción lítica de estas proteinasas sobre la membrana vitelina del ovocito no activado.

d) Para que estas enzimas actúen a corto plazo es condición necesaria que los ovocitos hayan sido

previamente sometidos a la acción de un factor secretado por la pars recta del oviducto.

e) La fecundación de los ovocitos de cavidad es posible en condiciones experimentales, siempre que,

además de haberse completado la maduración nuclear, hayan sido tratados con el producto de

secreción de la pars recta .

f) Tanto el ataque de la membrana vitelina por las lisinas espermáticas como la fecundación pueden ser bloqueados por los inhibidores de proteinasas y por la concanavalina A ( que se une específicamente a las glicoproteínas de la membrana vitelina ).

g) El pasaje del espermatozoide a través de la ganga no requiere la ruptura del acrosoma.

Basados en estos resultados y en los obtenidos por otros autores es posible esquematizar la fecundación de los anfibios anuros en los siguientes pasos:

1.- Los espermatozoides con auxilio de los factores de coordinación provistos por las cubiertas de los gametos femeninos se ponen en contacto con la ganga y la. atraviesan.

2. -En la vecindad de la membrana vitelina del ovocito se produce la reacción acrosómica y las proteinasas liberadas atacan la membrana permitiendo el pasaje del espermatozoide.

5.- El ovocito reacciona a 1a entrada del espermatozoide con la ruptura de los gránulos

corticales lo que determina, entre otros efectos, una modificación de la corteza ovocitaria y de la

membrana vitelina que impide la penetración de otros espermatozoides.

Este esquema está basado en los datos experimentales disponibles en la actualidad, lo que no excluye que existan otros pasos tales como una interacción entre los factores de coordinación y el espermatozoide, la mediación de receptores de membrana específicos entre el ovocito y el espermatozoide o procesos especiales a nivel de la membrana plasmática de los gametos para posibilitar la singamia.

Para que este esquema se cumpla es necesario:

a) Que el ovocito se encuentre maduro para poder reaccionar adecuadamente.

b) Que la barrera que representa la membrana vitelina del ovocito haya sido modificada ( ya sea

natural o artificialmente ) para posibilitar el pasaje del espermatozoide.

c) Que el espermatozoide este en condiciones ya sea de atravesar la membrana vitelina o de fusionarse con la membrana plasmática.

Suspensión hipofisaria: Las suspensiones se prepararon triturando alrededor de 50 hipófisis en 50 ml de agua destilada, las que fraccionadas en muestras de un mililitro se conservaron a -20 °C, sin perdida aparente de actividad.

Na Cl 3,50 gr

K Cl 0,05 gr

Ca Cl ₂ 0,10 gr

Na HO₃C 0,20 gr

H₂ O c.s.p 1 litro

Solución de Ringer

Na Cl 6,60 gr

K Cl 0,15 gr

Ca Cl₂ 0,15 gr

H₂ O c.s.p 1 litro

El decimal ,en el texto, indica las veces que se diluyó la solución.

Los inhibidores de proteinasas se encuentran ampliamente distribuidos en el reino vegetal y animal o bien tienen un origen sintético. La mayoría de ellos se aislan bajo el nombre de "inhibidores de tripsina", sin embargo prácticamente sin excepción inhiben a otras proteinasas (14). Las características de los inhibidores utilizados son las siguientes:

Trozos de testículos se suspendieron en las diferentes soluciones. Las suspensiones se llevaron a una concentración de 10⁶ espermatozoides/ml y se incubaron a 24 °C. A los tiempos señalados se tomaron alicuotas que se fijaron en glutaraldehido al 2,5 %. El recuento diferencial de las diversas fases se realizó con un microscopio Wild M20 equipado con contraste de fases. Los resultados se expresan como porcentajes en cada fase.

TABLA 2

Espermatozoides de Leptodactylus chaquensis fueron incubados en film de gelatina de colágeno en presencia de inhibidores de tripsina.

La concentración final de los inhibidores fue de 0,30 mg/ml.

La diferencia es significativa entre los pares de valores ba, ca, da.

TABLA 3

La diferencia es significativa con un p < 0,005 y p <0,0005 para los valores indicados con (°) y (°°) respectivamente, referidos al control.

n=5.

(1) Los datos corresponden a valores obtenidos luego de 5 minutos de incubación.

TABLA 4

Espermatozoides de Leptodactylus chaquensis fueron incubados en film de gelatina de colágeno en presencia de EDTA 10 mM.

(°) No significativo respecto al control

TABLA 5

Ensayos con gelatina y BAPNA iguales que en Tabla 3.

El crudo enzimático contiene 0,85 mg /ml de proteínas.

(°) No significativo respecto a los controles.

TABLA 6

Muestras de alrededor de 100 ovocitos con y sin espuma se inseminaron con 0,5 ml de una

suspensión de espermatozoides (10 ⁶ esp. / ml).

n=2

TABLA 7

Tiempo de permanencia de los ovocitos de Leptodactylus chaquensis en solución salina y fecundidad

Muestras de ovocitos que permanecieron tiempos crecientes en Holtfreter 0,1 fueron inseminados con suspensiones recientemente preparadas de espermatozoides (10 ⁶ esp. / ml).

n=2

TABLA 8

Muestras de ovocitos fueron inseminados con alicuotas de 0,5 ml de una suspensión de espermatozoides (10 ⁶ esp. / ml) previamente incubados en Holtfreter 0,1 a 24 °C.

Tabla 9

Ovocitos maduros en grupos de 200-300 se mantuvieron en cámara húmeda hasta su inseminación.

Las suspensiones de espermatozoides (10⁶ esp. / ml) se prepararon en solución de sacarosa 0,25 M ó 0,025 M y se incubaron a 25 ± 2 °C. Alicuotas de 0,5 ml se utilizaron para inseminar los ovocitos luego de 0-5-10 y 30 minutos de su preparación . La motilidad y las fases del acrosoma se controlaron en alicuotas tomadas en el momento de la inseminación (otros detalles en Tabla 1 ). Cinco minutos después de la inseminación 2,5 ml de Holtfreter 0,1 fueron agregados a cada muestra.

Tabla 10

inhibidores de tripsina y fecundacion

Ovocitos de Bufo arenarum con y sin ganga se inseminaron en presencia de SBTI. Los resultados que difieren significativamente de los controles son: (°) < 0,0005; (°°) < 0,005; (°°°) < 0,0125. n=5

Tabla 11

Ovocitos de Bufo arenarum con y sin ganga se inseminaron en presencia de ovomucoide. Los resultados que difieren significativamente de los controles son: (°) p < 0,025; (°°) < 0,05; (°°°) p < 0,001. n=5

TABLA12"> Tabla 12

Inhibidores de tripsina y fecundación

<CENTER><TABLE BORDER="5" CELLSPACING="1" CELLPADDING="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

LBTI(mg /ml)

Ovocitos con ganga fecundados; M ± EEM

Ovocitos sin ganga fecundados; M ± EEM

--

77,5 ± 8,1 %

74,4 ± 4,4 %

10

14,4 ± 7,8 % (°)

5

54,8 ± 9,9 %

2,5

58,4 ± 5,6 % (°°°°°)

1,25

61,0 ± 7,6 %

1,00

40,9 ± 6,5 % (°°)

0,60

76,4 ± 8,4 %

0,50

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">55,6 ± 6,0 % (°°°°)

0,25

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">62,2 ± 7,5 %

0,12

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">46,8 ± 6,9 % (°°°)

0,06

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">61,4 ± 4,0 % (°°°°°)

Ovocitos de Bufo arenarum con y sin ganga se inseminaron en presencia de LBTI. Los resultados que difieren significativamente de los controles son: (°) p &lt; 0,0005; (°°) p &lt; 0,0025; (°°°) p &lt; 0,005; (°°°°) p&lt; 0,0125; (°°°°°) p&lt; 0,05.

n=5 18

TABLA13"> TABLA 13

Actividad lítica de las suspensiones de espermatozides sobre ovocitos degangados

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Experimento

Agregado al medio

Efecto lítico en degangados con KCN

Efecto lítico en degangados con tioglicólico

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">1

Espermatozoides

Ringer 0,1

+

-

+

-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">2

Espermatozoides

Ringer 0,1

+

-

+

-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">5

Espermatozoides

+

-

+

-

Ovocitos de Bufo arenarum degangados en dos formas se colocaron en 2,5 ml de Ringer 0,1 se les agregó 0,5 ml de espermatozoides (concentración final 5.10 ⁶ esp./ ml). La tabla indica con + las muestras donde se observó efecto lítico sobre la membrana vitelina. Las observaciones se realizaron con un microscopio estereoscópico Wild M5. 19

Tabla 14

Actividad lítica y concentración de los espermatozoides

TABLA14">

Concentración de espermatozoides

Efecto lítico

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">1,9 . 10 ⁷

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">6,2 . 10 ⁶

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">2,4. 10 ⁶

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">1,4.10⁶

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">5,9.10 ⁵

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

La Tabla indica en cruces el valor relativo del efecto lítico observado luego del agregado de la suspensión de espermatozoides a ovocitos degangados con KCN.

Los controles se mantuvieron en Ringer 0,1

Otros detalles ver en Tabla 15. 20

TABLA15"> Tabla 15

<H4> Efectos de la activación sobre la acción lítica de los espermatozoides </H4>

<CENTER><TABLE BORDER="5" CELLSPACING="1" CELLPADDING="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Experimento

Efecto lítico sobre ovocitos no activados

Efecto lítico sobre ovocitos activados

1

+

-

2

+

-

5

+

-

Se utilizaron ovocitos degangados con KCN. Grupos de alrededor de 50 ovocitos se activaron y se pusieron en presencia de suspensiones de espermatozoides (5.10 ⁶ esp. / ml). Los resultados se expresan como en la Tabla 15. 21

TABLA16"> TABLA 16

EFECTO LITICO DE LOS SOBRENADANTES DE ESPERMATOZOIDES

<CENTER><TABLE BORDER="5" CELLSPACING="1" CELLPADDING="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Eperimentos

Efecto lítico del sobrenadante

Ringer 0,1

1

+

-

2

+

-

5

+

-

El sobrenadante se obtuvo por centrifugación a 20.000 g durante 30 minutos (a 4 °C) de una suspensión de espermatozoides (20.10 ⁶ esp. / ml) previamente incubada a 20 °C durante 6 horas en Ringer 0,1.

Los resultados se expresan como en la Tabla 15. 22

TABLA17"> Tabla 17

Demostración experimental de la asociación del efecto lícito con el espermatozoide> .

La actividad fue ensayada sobre ovocitos degangados con KCN. 25

TABLA18"> Tabla 18

Efectos de las suspensiones de espermatozoides de diferentes especies de anuros sobre la membrana vitelina de los ovocitos de Bufo arenarum

<CENTER><TABLE BORDER="5" CELLSPACING="1" CELLPADDING="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Origen de los espermatozoides

Efecto lítico

Bufo arenarum

+

Leptodactylus bufonius

+

Leptodactylus chaquensis

+

Leptodactylus prognatus

+

Phyllomedusa sauvagii

+

Las diferentes suspensiones se pusieron en contacto con muestras de alrededor de 50 ovocitos de Bufo arenarum degangados con KCN.

Los resultados se indica como en la tabla 15. 24

TABLA19"> Tabla 19

Inhibidores de proteinasas y lisis de la membrana vitelina

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Enzima/s

Inhibidor

Efecto lítico a 30 seg.

Efecto lítico a 3 minutos

Efecto lítico a 10 minutos

Efecto lítico a 30 minutos

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">E .C. L (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Ovomucoide (2 mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">E . C. L (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">L B T I (0,5mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">E . C. L (0,15 mg/ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">S B T I (0,5mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">E . C . L (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">--

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Tripsina (0,15 mg /ml)

Ovomucoide ( 2 mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Tripsina (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">L B T I (0,5mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Tripsina (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">S B T I (0,5mg / ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Tripsina (0,15 mg /ml)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">--

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++++

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">++++

Ovocitos de Bufo arenarum degangados con KCN se trataron con extractos crudos de lisina homóloga y con tripsina en presencia de inhibidores de proteinasas. Los paréntesis indican las .concentraciones finales de enzimas e inhibidores

Los resultados se expresan en forma relativa con cruces en las muestras en las cuales se observa ataque a la membrana vitelina. 25

Tabla 20

Efecto de la Cocanavalina A sobre la actividad de la espermatolisina

TABLA20">

<TABLE BORDER="1" ALIGN="DEFAULT">

Pretratamiento

Efecto lítico

Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6

+

Concanavalina A ( 500 ug / ml)

-

Concanavalina A (250 ug / ml )

-

Concanavalina A (125 ug / ml)

-

Concanavalina A ( 60 ug / ml )

-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Concanavalina A ( 50 ug / ml )

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">-

Ovocitos de cavidad condicionados de Bufo arenarum se pretrataron con diferentes concentraciones de concanavalina A (disuelta en Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 ) durante 30 minutos. Luego del tratamiento se lavaron abundantemente con agua corriente y Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y se los colocó en cápsulas de plástico ( 0,5 de volumen total) contenientes extractos crudos de lisina ( 0,15 mg / ml de proteínas). 26

Tabla 21

Inhibicion del efecto de la Concanavalina A sobre la membrana vitelina

TABLA21">

<TABLE BORDER="1" ALIGN="DEFAULT">

Pretratamiento

Efecto lítico

Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6

+

Concanavalina A ( 60 ug / ml)

-

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Concanavalina A (50 ug / ml ) +

<FONT FACE="Symbol">a</FONT>-Metil-D-Manosido 0,2 M

+

Concanavalina A (50 ug / ml) +

<FONT FACE="Symbol">a</FONT>-Metil-D-glucosido 0,2 M

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">+

Concanavalina A ( 60 ug / ml ) +

M.V.S. (1,7 mg / ml)

+

El procedimiento seguido es similar al de la Tabla 20, salvo en aquellos casos en que se agregó al medio de pretratamiento los azúcares en las concentraciones finales que se señalan en la Tabla.. 27

Tabla 22

Efecto de la Concanavalina A sobre la fecundación de los ovocitos sin ganga

TABLA22">

<TABLE BORDER="1" ALIGN="DEFAULT">

Concanavalina A (ug / ml)

Ovocitos fecundados(%)

M±EEM

--

85,2 ± 7,5

10

25,2 ± 5,2

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">50

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,0 ± 0,0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">60

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,0 ± 0,0

Grupos de aproximadamente 25 ovocitos de cavidad condicionados se pretrataron con 0,500 ml de concentraciones crecientes de concanavalina A disuelta en Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 durante treinta minutos. Luego del tratamiento se lavaron 5 veces con 5,0 ml de Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y se inseminaron en un volumen final de 0,500 ml (0,250 ml de Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 + 0,250 ml de 1008"> fd">F.D. ) al que se agregó 0,020 ml de espermatozoides (2. 10 ⁸ esp./ ml ). n=5 28

Tabla 23

Efecto de la Concanavalina A sobre la fecundación de los ovocitos con ganga

TABLA23">

<TABLE BORDER="1" ALIGN="DEFAULT">

Concanavalina A (ug / ml)

Ovocitos fecundados(%), M±EEM

--

96,4 ± 1,5

50

68,4 ± 9,6

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">60

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">55,8 ± 11,5

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">125

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">15,4 ± 5,0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">250

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">6,4 ± 5,0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">500

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">1,0 ± 1,0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">1000

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,0 ± 5,0

Tiras de aproximadamente 25 ovocitos se pretrataron con 0,500 ml de concentraciones crecientes de concanavalina A disuelta en Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 durante 30 min.Las tiras fueron lavadas bajo chorro de agua durante 15 segundos, se colocaron en cápsulas de plástico (0,5 ml vol. total ) y se inseminaron con 0,021 ml de una suspensión de espermatozoides (2,2. 10 ⁸ esp. / ml). Luego de 5 minutos se agrego a las cápsulas Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6. n=5 29

Tabla 24

Inhibicion del efecto de la Concanavalina A sobre la fecundación

TABLA24">

<TABLE BORDER="1" ALIGN="DEFAULT">

Agregado al medio de incubación

Ovocitos fecundados( %)

M ± EEM

-

0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">

<FONT FACE="Symbol">a</FONT>-Metil-D-Manosido (0,2 M)

59,2 ± 12,7

<FONT FACE="Symbol">a</FONT>-Metil-D-glucosido (0,2 M)

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">12,7 ± 2,8

M.V.S. (1,7 mg / ml)

54,2 ± 11,4

Ovocitos de cavidad condicionados se incubaron con una concentración de 60 ug / ml de concanavalina A. Al medio de incubación se agrego, en cada caso, los respectivos inhibidores en las concentraciones finales que se señalan en la Tabla. Luego de 30 minutos las muestras se procesaron al igual que en la Tabla 22. n= 5 50

Tabla 25

Fenomenos que acontecen en el ovocito en función del tiempo transcurrido desde la inyección hipofisaria

TABLA25">

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Fenomenos

5 y 15 Hs.

5 y 45 Hs.

6 y 15 Hs.

7 y 15 Hs.

7 y 45 Hs.

Rotacion

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">17

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">99

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

Segmentacion

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">64

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

Gastrulacion

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">52

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">99

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">100

La experiencia se realizo con un ejemplar hembra de Bufo arenarum consservado a 7 °C. Doce horas antes del experimento se llevo a 25 ± 2 °C. La obtencion de los ovocitos se realizo de la manera usual y se conservaron en cámara húmeda a 25 ± 2 °C.

Grupos de aproximadamente 100 ovocitos se inseminaron sucesivamente con espermatozoides provenientes del mismo animal.

Las cifras indican porcentaje de ovocitos. 51

Tabla 26

Inseminacion de ovocitos obtenidos de la cavidad celómica y de la pars recta del oviducto

TABLA26">

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center" WIDTH="100%">

Origen de los ovocitos

Ovocitos fecundados ( % ) M± EEM

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE"> pars recta

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">84,8 ± 5,5

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Cavidad

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,8 ± 0,8

Ovocitos maduros obtenidos de la pars recta y de la cavidad del cuerpo se colocaron en 2,5 ml de Holtfreter 0,1 y se inseminaron con 0,5 ml de una suspensión de espermatozoides ( 1 10 ⁸ esp. /ml ) 52

Tabla 27

Efecto del homogenado de pars recta en la fecundación de los ovocitos de cavidad

TABLA27">

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center">

Pretratamiento

Ovocitos fecundados ( % ) M± EEM

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Holtfreter

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,0 ± 0,0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Homogenado de pars recta

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">66,0 ± 15,1

Ovocitos maduros obtenidos de la cavidad del cuerpo fueron incubados en Holtfreter standart y homogenado de pars recta durante treinta minutos. Las muestras se lavaron tres veces con 50 ml de Holtfreter 0,1 y se inseminaron. El medio de inseminación contenía 2,5 ml de Holtfreter 0,1 y al mismo se agregaron 0,5 ml de una suspensión de espermatozoides (1.10⁸ esp / ml)

n=5 55

TABLA28"> Tabla 28

Efecto de la temperatura sobre el homogenado de pars recta

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center">

Pretratamiento

Ovocitos fecundados ( % )

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Homogenado de pars recta

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">55

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Homogenado de pars recta inactivado por calor

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0

Una alicuota de homogenado de pars recta se inactivo durante 5 minutos en agua hirviendo. La prueba de actividad se realizo sobre ovocitos de cavidad en las condiciones de la Tabla 27. 54

TABLA29">

Dialisis de homogenado de pars recta

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center">

Pretratamiento

Ovocitos fecundados ( % )

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Dializado

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Retenido

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">80

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Homogenado de pars recta

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">42

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Ringer

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0

Un mililitro de homogenado de pars recta se dializo a 4 °C contra un ml de Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 durante 12 horas. El mililitro de dializado se conservo y la tripa de diálisis se volvió a dializar durante 8 horas a 4 °C contra 500 ml de Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6.

El primer dializado y el retenido se utilizaron para incubar ovocitos de cavidad (maduros desde el punto de vista nuclear) durante media hora. Los ovocitos se lavaron en Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y se colocaron en 2,5 ml de Ringer y se inseminaron con 0,5 ml de suspensión de espermatozoides (1 testículo / 1 ml de Ringer 0,1) 55

TABLA30"> Tabla 30

Accion del suero anti pars recta sobre la fecundidad de los ovocitos condicionados

<CENTER><TABLE BORDER="1" ALIGN="center">

Pre - incubación

Ovocitos fecundados ( % ) M ± EEM

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Suero normal

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">46,4 ± 2,6

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">Suero anti pars recta

<TD ALIGN="CENTER" VALIGN="MIDDLE">0,0 ± 0,0

Ovocitos condicionados se trataron con suero normal y suero anti pars recta durante 2 horas. Luego del tratamiento, los ovocitos se lavaron con Holtfreter 0,1 y se inseminaron en condiciones similares a las descriptas en la Tabla 25. 56

n=5

BIBLIOGRAFIA

1) Raisman J.S., Barbieri F.D. (1969) Acta Embryol. Exp. 17-26.

2) Raisman J.S. (1970) V Congreso Argentino de Biología (Comunicación).

3) Raisman J.S., W. de Cunio R. (1973) VI Congreso Argentino de Biología (Comunicación).

4) Raisman J.S., W. de Cunio R., Pisanó A., (1973) VI Congreso Argentino de Biología (Comunicación).

5) Raisman J.S., Cabada O.M. (1974) Manuscrito en preparación

6) Cabada O. M, Raisman J.S., Mariano M. (1974) Manuscrito en preparación

7) Houssay B.A., Giusti L., Lascano Gonzalez J.M. (1929) Rev. Soc. Argent. Biol., 102 , 864.

8) Allende I.L.C., Orías O. (1955) Acta Physiol. Latinoam. 5 ,57.

9) Fernandez K., Fernandez M. (1921) Anales de la Sociedad Científica Argentina XCI , 97.

10) W. de Cunio R., Raisman J.S. Resultados no publicados.

11) Diberardino M.A. (1962) Develop. Biol. 5 ,101.

12) Gaddum P., Blandau R.J. (1970) Science 17O , 749.

13) Benitez-Bribiesca L. , Velázques-Meza S. (1972) J.Reprod. Fert. 29 ,419.

B14">14) Naturally ocurring Activators and Inhibitors of proteolytic enzymes in Methods in Enzymology (1970) XIX , Section IV, De. G. E. Perlman y L.Lorand,

Academic Press. i14

B15">15) Gaddum R. P., Blandau R.J. (1972) Am. J. Anat. 134 ,133. i15

B16">16) Lowry O. H., Rosebrough N. J., Farr A. y Randall R.J. (1951) J. Biol. Chem.

193 ,215. i16

B17">17) Moore S., Stern W.H. (1948) J. Biol. Chem. 176 ,367. i17

B18">18) Erlanger B. F. , Kokowsky N., Cohen W. (1961) Arch. Biochem. Biophys. 95 , 271. i18

B19">19) Moreno A.R. (1972) Rev. Agron. N. O. Argentino 9 ,585. i19

B20">20) Barbieri F.D. , Del del Pino E. (1973) Manuscrito en preparación. i20

B21">21) Avrameas M.S., Tréfouel M.J. (1970) C. R. Acad. Sc. Paris 270 ,2205. i21

B22">22) Hartree E.F. (1971) ,pg. 271 en Of microbes and life, Ed. J.Monod y E. Borek, Columbia University Press. i22

B23">23) Pikó L. (1969) pg. 325 en Fertilization, vol.II, Ed.A. Monroy, Academic Press. i23

B24">24) Mattei X. (1969) Pg. 57 en Comparative Spermatology, Ed. B. Baccetti, Academic Press. i23

B25">25) Elinson R.P. (1971) J. Exp. Zool. 177 , 207. i25

B26">26) Dan J. (1969) , pg. 237 en Fertilization, Vol. I, Ed. A. Monroy, Academic Press. i26

B27">27) Colwin A.L., Colwin H.L. (1969) pg.295 en Fertilization, vol I Ed. A. Monroy, Academic Press. i27

B28">28) Austin C. R. (1965) , pg. 65 en Fertilization, Ed. C.L. Market, Prentice Hall. i28

B29">29) Barbieri F.D. (1950) Acta Zool. Lilloana 9 ,455. i29

B30">30) Burgos M.H., Fawcett D.W. (1956) J. Biophysic. and Biochem. Cytol. 2 , 223. i30

B31">31) Nicander L. (1969) pg. 47 en Comparative Spermatology, Ed. B. Baccetti, Academic Press. i31

B32">32) Poirier G.R., Spink G.C. (1971) J. Ultrastruc. Res. 36 , 455. i32

B33">33) Mariano M., Raisman J.S. Trabajo en curso. i33

B34">34) Cei J.M. (1950) Acta Zool.Lilloana 9 ,395. i34

B35"> 35) W. de Cunio R., Raisman J.S. (1974) Película, 4 minutos 30 segundos de duración presentada en la Sociedad de Biología, S.M. de Tucumán. Una versión extractada en formato digital se agregó a la presente. i35

B36">36) Penn A., Gledhill B. L. (1972) Exp. Cell Res. 74 ,285. i36

B37">37) Zaneveld L. J. D., Polakosky K.L., Williams W.L. (1973) Biol. Reprod.. 9 , 212. i37

B38">38) Cei J. M. (1948) Acta. Zool.Lilloana 6 , 283. i38

B39">39) Barbieri F.D. (1956) Arch. de Bioq. Quim. y Farm. Tucumán, 7 , 267. i39

B40">40) Del Rio A., Raisman J.S. Experimentos no publicados. i40

B41">41) Wolf D. P., Hedrick J. L. (1971) Develop. Biol. 25 ,348. i41

B42">42) Yanigamachi R. (1969) J. Exp. Zool. 170 , 269. i42

B43">43) Greenslade F.C., Mc Cormack J. J., Hirch A. F., Davanzo J.P. (1973) Biol. Reprod. 8 , 306. i43

B44">44) Wischnitzer S. (1966) Adva. Morphogen. 5 , 131. i44

B45">45) Wolf, D. P. (1973) Biol.Reprod. 9 ,72. i45

B46">46) Townes P.L. (1952) Exp. Cell Res. 4 , 96. i46

B47">47) Elinson R.P. (1973) J. Exp. Zool. 183 , 291. i47

B48">48) Spiegel M. (1951) Anat. Rec. 111 , 544. i48

B49">49) Wolf D. P., Hedrick J. L. (1971) Fed.Proc., Fed. Amer. Soc. Exp.Biol. 30 , 1070. i49

B50">50) Wolf D. P. (1971) Biol. Reprod. 5 , 99a. i50

B51">51) Motomura I. (1952) Annot. Zool. Jap. 25 , 238. i51

B52">52) Balinsky B.I. (1966) Acta Embryol. Morphol. Exp. 9 , 132. i52

B53">53) Kemp N.E., Istock N. L. (1967) J. Cell Biol. 34 , 111. i53

B54">54) Grey D.R., Wolf D.P., Hedríck J. L. (1974) Develop. Biol. 36 , 44. i54

B55">55) Wolf D. P. (1974) Develop. Biol. 36 ,62. i55

B56">56) Wolf D. P. (1974) Devolop. Biol., 38 ,14. i56

B57">57) Vacquier V. D., Epel D., Douglas L.A. (1972) Nature 237 ,34. i57

B58">58) Vacquier V.D., Tegner M. J., Epel D. (1972) Nature 240 , 352. i58

B59">59) Schuel H., Wilson W. L. , Chen K., Lorand L. (1973) Develop. Biol.

34 , 175. i59

B60">60) Gwatkin R.B.L., Williams D. T., Hartman J. F., Kniazuk M. (1973) J. Reprod. Fert. 32 , 259. i60

B61">61) Mariano M., Raisman J.S., Trabajo en curso. i61

B62">62) Stambaugh R., Buckley J. (1968) Science 161 ,585. i62

B63">63) Stambaugh R., Buckley J. (1969) J.Reprod. Fertil. 19 , 423. i65

B64">64) Polakosky K.L., Zaneveld L. J. D., Williams W.L. (1972) Biol. Reprod. 6 , 23. i64

B65">65) Koren E., Milkovics S. (1973) J. Reprod. Fertil. 32 ,349. i65

B66">66) Bryan J. H. D., Unnithan R.R. (1973) Histochemie 33 , 169. i66

B67">67) Gonzalez L.W., Meisel S. (1973) Biochim. Biophys. Acta 320 , 166 i67

B68">68) Gonzalez L.W., Meizel S, (1973) Biochim. Biophys. Acta 320 ,180. i68

B69">69) Zaneveld L. J. D., Schumacher G.F.B., Travis J. (1973) Fert. Steril. 24 , 479. i69

B70">70) Bryan J. H. D., Unnithan R. R. (1974) Histochem. J. 4 , 413. i70

B71">71) Yang C. H. , Srivastava P. N. (1974) J. Reprod. Fert. 37 ,17. i71

B72">72) Yang C. H. , Srivastava P. N. (1974) Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 145 , 721. i72

B73">73) Howarth B., Digby S. T. (1973) J. Reprod. Fert. 33 , 123. i73

B74">74) Katagiri Ch. (1959) J. Fac. Sci. Hokkaido Univ., Ser. VI (Zool.) 14 ,166. i74

B75">75) Sharon N., Lis H. (1972) Science 117 , 949. i75

B76">76) Lis H., Sharon N. (1973) Annu. Rev. Biochem. 42 , 541. i76

B77">77) Oikawa T., Yanigamachi R., Nicolson G.L. (1973) Nature 241 , 256. i77

B78">78) Oikawa T., Nicolson G.L., Yanigamachi R. (1974) Exp. Cell Res. 83 , 239. i78

B79">79) O'Dell D. S. (1972) Cytobios 6 , 91. i79

B80">80) Edelman G. M. y Millette C. F. (1971) Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 68 , 2436. i80

B81">81) Rugh R. (1935) J. Exp. Zool. 71 , 163. i81

B82">82) Good G.M., Daniel J.F. (1943) University of California Pub.Zool. 51 , 149. i82

B83">83) Kambara S. (1953) Annot. Zool. Jap. 26 , 78. i83

B84">84) Tchou-su, Wang Y.L. (1956) Acta Exp. Biol. Sinica 5 , 75. i84

B85">85) Nadamitsu S. (1957) L. Sci. Hiroschima Univ. Ser. B. Div. 1, 17 , 51. i85

B86">86) Aplington H.W. (1957) Ohio J.Sci. 57 91. i86

B87">87) Shaver J.R., Barch S. H. (1960) Acta Embryol. Morphol-Exp. 3 , 180 i87

B88">88) Katagiri C.(1965) J.Fac. Sci.Hokkaido Univ. Ser.6 15 , 633. i88

B89">89) Barbieri F.D., Raisman J.S. (1969) Embryologia 10 ,363. i89

B90">90) Shivers C.A., James J.M. (1970) Nature 227 , 183. i90

B91">91) Elinson R.P. (1971) J. Exp. Zool. 176 , 415. i91

B92">92) Wolf D.P., Hedrick J.L. (1971) Develop. Biol. 25 ,360. i92

B93">93) Katagirl Ch. (1966) J. Fac. Sci. Hokkaido Univ. Ser.Vl (zool.) 16 ,77. i93

B94">94) Katagiri Ch. (1966) Embryologia 9 , 259. i94

B95">95) Katagiri Ch. (1967) Annot. Zool. Jap. 40 , 67. i95

B96">96) Raisman J.S., Pisanó A. (1970) Acta Embryol. Exp. 1 , 3.

i96

B97">97) Barbieri F.D., Villecco E. I. (1966) Arch. Zool. Ital. 51 , 227. i97

<a name="B98">98) Barbieri F.D., Cabada O. M. (1969) Experientia 23 , 1312. i98

B99">99) Barbieri F.D., Oterino J. M. (1972) Develop.Growth Differ. 14 , 107.