SECRECIONES DEL OVIDUCTO Y ACCIÓN DE LAS PROTEINASAS: SU RELACIÓN CON LA FECUNDACIÓN

Contenidos
Ovocitos sin ganga | Estado de maduración de los ovocitos | Ovocito en función del tiempo desde la inyección hipofisaria | Secreciones del oviducto y ataque a la membrana vitelina | Efecto del homogenado de pars recta | Efecto del homogenado de pars recta | Fecundación de ovocitos de cavidad pretratados con pars recta | Algunas propiedades del factor pars recta | Localización del factor pars recta

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   Es un hecho bien conocido en Embriología experimental que los ovocitos de anfibios desprovistos de su ganga no se fecundan cuando se inseminan en condiciones normales (, , , , , , , , , , , ). 
   En realidad cuando se habla de ovocitos sin ganga es necesario distinguir dos tipos distintos. El primero, corresponde a aquellos a los cuales se ha quitado artificialmente su ganga por medio de diferentes métodos ( tratamiento con cianuro de sodio, tioglicolato de sodio, irradiación ultra violeta, etc ) y se conocen como degangados. El segundo, corresponde a los ovocitos tomados de la cavidad celómica y que carecen de ganga por no haber pasado a través del oviducto.
   Los ovocitos degangados han sido fecundados en una gran variedad de condiciones experimentales (, , , , , , , ) la mayor parte de ellas basadas en la inseminación en presencia de diversos productos provenientes de la ganga, lo que indica claramente la importancia de algunos de sus componentes moleculares para la fecundación (, , ,).
   En nuestro laboratorio hemos conseguido fecundar ovocitos degangados, inseminando a los mismos en presencia de altas concentraciones de espermatozoides (), sin necesidad de adicionar ningún tipo de producto al medio. Es posible que este tipo de inseminación haya tenido éxito debido a la exacerbación de un mecanismo normal de la fecundación. En efecto, si normalmente el espermatozoide utiliza sus proteinasas acrosómicas para franquear la barrera que representa la membrana vitelina, es probable que en presencia de altas concentraciones de espermatozoides la gran cantidad de proteinasas liberadas por reacciones acrosómicas espontáneas haya modificado la barrera de la membrana y permitido por lo tanto la fecundación.
   En contraste con las experiencias realizadas con ovocitos degangados, no ha sido posible obtener, en las mismas condiciones, altos porcentajes de fecundación con ovocitos de cavidad (, , ).
   En Rana pipiens se ha señalado que utilizando espermatozoides que estuvieron en contacto con ovocitos con gelatina es posible producir fenómenos de activación en ovocitos de cavidad, pero la interpretación de estos resultados es bastante difícil ya que los ovocitos no progresan en su desarrollo ().
   En nuestro laboratorio hemos logrado, en algunas oportunidades, fecundar ovocitos de cavidad utilizado altas concentraciones de espermatozoides y en Rana pípiens ocasionalmente se obtuvo este mismo resultado utilizando agua de huevos y altas concentraciones de espermatozoides ().
   También en Rana pipiens se obtuvo fecundación de ovocitos de cavidad alterando la membrana vitelina con agentes tales como el NaCN y la tripsina o bien utilizando espermatozoides heterólogos (, ). Por otra partes en Bufo bufo la eliminación de la membrana vitelina con pronasa permite obtener altos porcentajes de fecundación ().
   Resumiendo, en aquellos casos en los que se obtuvo fecundación de ovocitos de cavidad se necesitó alterar de una u otra forma la barrera representada por la membrana vitelina, por lo tanto uno de los factores que condiciona la penetración del espermatozoide es el estado en que se encuentra la misma. Resulta particularmente interesante que con altas concentraciones de espermatozoides (lo cual implica presencia de gran cantidad de proteinasas acrosómicas en el medio) o mediante el pretratamiento con tripsina, se logra fecundar a los ovocitos de cavidad.
   Es posible, por lo tanto, que uno de los factores claves en la fecundación sea la diferente susceptibilidad de la membrana vitelina a las proteinasas acrosómicas.
   Dado que la diferente respuesta de los ovocitos degangados y de cavidad a la inseminación se corresponde con el hecho que los últimos no pasaron a través del oviducto, esta susceptibilidad estaría conferida en ultima instancia por las secreciones del conducto femenino. Esta hipótesis propuesta por diversos autores (, , , , ) ha sido sometida al control experimental en nuestro laboratorio.
   De resultar correcta, posibilitaría la fecundación de los ovocitos de cavidad en condiciones similares a los ovocitos degangados. En este sentido es oportuno citar literalmente lo expresado por Rugh () : Si resultase posible la fecundación de ovocitos de cavidad y se lograse el desarrollo normal de los mismos sin gelatina, este hecho será un "boom" para la Embriología experimental...

   Antes de intentar fecundar a los ovocitos de cavidad en base a esta hipótesis fue necesario, obviamente, controlar el estado de maduración nuclear de los mismos.

Estado de maduración de los ovocitos | a Contenidos

   Dado que bajo este termino se ha descrito una amplia gama de procesos, es necesario precisar que en este caso se empleará para señalar los fenómenos que ocurren desde la ovogénesis a termino (ovocitos en profase de la primera división meiótica) hasta que expulsan el primer glóbulo polar y se detienen en la metafase de la segunda división meiótica ().

   Es sabido, que por acción de las hormonas hipofisarias que actúan a través de un mediador químico segregado por las células foliculares (probablemente progesterona o un esteroide muy semejante), el ovocito rompe su vesícula germinal (núcleo en profase de la primera división meiótica) y reinicia los procesos nucleares que lo llevan a la metafase de la segunda división, punto en el cual el proceso se bloquea nuevamente hasta la entrada del espermatozoide (, ,, , , , , ).
   Paralelamente, ocurren una serie de cambios estructurales y fisiológicos que posibilitan el futuro desarrollo del embrión (). Dado que todos estos cambios se inician por acción de la estimulación hipofisaria, el hecho de que un ovocito se encuentre en el estadio correcto de maduración es función del tiempo transcurrido desde la iniciación de dicho estímulo.
   Para este tipo de experiencias, Bufo arenarum provee un material muy conveniente. Animales inyectados con suspensión hipofisaria y mantenidos a temperatura adecuada permiten la obtención de ovocitos tanto a nivel del ovisaco como de la cavidad del cuerpo en un mismo ejemplar.
   La observación de las imágenes morfológicas que caracterizan a los diferentes estadios de maduración indicó que para un tiempo dado las mismas eran similares, independientemente de que los ovocitos se encuentren en la cavidad o en ovisaco (Fíg. 15). En ambos casos los ovocitos mantenidos "in vitro" llegan hasta la metafase de la segunda división meiótica (Fig. 15: b y d).

   Inseminaciones sucesivas de ovocitos uterinos mostraron que, considerando como punto inicial el momento de la inyección hipofisaria, el resultado obtenido variaba con el tiempo. Para tiempos muy cortos la mayoría de los ovocitos no presentan signos externos de activación, es decir que no rotan, ni la membrana vitelina se separa de la superficie del ovocito. A medida que transcurre el tiempo se observa que los ovocitos rotan pero la mayor parte de ellos no segmenta.
   Más adelante los ovocitos rotan y segmentos aunque muchos de ellos no llegan al periodo de gastrulación. Finalmente, luego de transcurridas mas de 6 horas 30 minutos, el 100% de los ovocitos consigue superar esta etapa. La Tabla 25 muestra como van apareciendo estos fenómenos en una experiencia tipo. La Fig. 16 muestra el aumento de los porcentajes de ovocitos fecundados a medida que transcurre el tiempo desde la inyección hipofisaria.

Fig. 16: Fecundidad de los ovocitos en función del tiempo de tratamiento con hormonas hipofisarias. Se trabajó con ejemplares hembras de Bufo arenarum aclimatadas a 25 ± 2 °C. La obtención de los ovocitos se realizó de la manera usual. Los mismos se mantuvieron en cámara húmeda y grupos de alrededor de 100 ovocitos se inseminaron sucesivamente con espermatozoides provenientes de un mismo animal. La figura representa el porcentaje de ovocitos fecundados (, n=5) en función del tiempo transcurrido desde la inyección hipofisaria.

Fig. 17: Efecto lítico de los espermatozoides sobre ovocitos de cavidad y de ovisaco 1: ovocito de cavidad; 2 ovocitos de ovisaco degangados. a: en ausencia de espermatozoides. b: 10 minutos después de agregar espermatozoides. c: aproximadamente 3 horas después de agregar los espermatozoides. DE: depresión que contiene el primer polocito.

Fecundación de ovocitos de cavidad pretratados con pars recta  | a Contenidos

El pretratamiento de ovocitos de cavidad por medio de homogenado de pars recta preparado a partir de animales tratados con hipófisis, condiciona a los mismos para que al ser inseminados se obtengan altos porcentajes de fecundación (Tabla 27). Por el contrario cuando el pretratamiento se realiza con oviductos no estimulados este efecto no se observa.

Tabla 27
Efecto del homogenado de pars recta en la fecundación de los ovocitos de cavidad
Pretratamiento	Ovocitos fecundados ( % )
Holtfreter	0,0 ± 0,0
Homogenado de pars recta	66,0 ± 15,1
Ovocitos maduros obtenidos de la cavidad del cuerpo fueron incubados en Holtfreter standart y homogenado de pars recta durante treinta minutos. Las muestras se lavaron tres veces con 50 ml de Holtfreter 0,1 y se inseminaron. El medio de inseminación contenía 2,5 ml de Holtfreter 0,1 y al mismo se agregaron 0,5 ml de una suspensión de espermatozoides (1.108  esp / ml). n=3

   Durante las experiencias se realizaron análisis cariológicos de gástrulas (obtenidas al azar). Las mismas mostraron cariotipo normal. Por otra parte tomando las debidas precauciones, el desarrollo se prolonga hasta la metamorfosis.

   La única diferencia apreciable entre la inseminación de los ovocitos condicionados con pars recta y los ovocitos con ganga, es un retardo en la aparición del primer surco. Esta diferencia puede ser explicada en base al retardo en la velocidad de fecundación (Fig. 18) ya que algunos datos obtenidos indican que los valores son bastante diferentes de los con ganga ( ).

Fig. 18: Velocidad de fecundación en ovocitos condicionados. Grupos de ovocitos de cavidad previamente condicionados se inseminaron (20 ovocitos en 0,490 ml de Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 + 0,010 ml de suspensión de espermatozoides conteniendo 2.10 8 células/ml). A tiempos diferentes el proceso se interrumpió por el agregado de  (20 mg/ml). Los puntos representan el promedio de dos experimentos.

Algunas propiedades del factor pars recta | a Contenidos

   El factor responsable del efecto biológico sobre los ovocitos es termolábil (Tabla 28) y no dializable. (Tabla 29)

Tabla 28
Efecto de la temperatura sobre el homogenado de pars recta
Pretratamiento	Ovocitos fecundados ( % )
Homogenado de pars recta	53
Homogenado de pars recta inactivado por calor	0
Una alícuota de homogenado de pars recta se inactivo durante 5 minutos en agua hirviendo. La prueba de actividad se realizo sobre ovocitos de cavidad en las condiciones de la Tabla 27.

 

Tabla 29
Dialisis de homogenado de pars recta
Pretratamiento	Ovocitos fecundados ( % )
Dializado	0
Retenido	80
Homogenado de pars recta	42
Ringer	0
Un mililitro de homogenado de pars recta se dializo a 4 °C contra un ml de Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 durante 12 horas. El mililitro de dializado se conservo y la tripa de diálisis se volvió a dializar durante 8 horas a 4 °C contra 500 ml de Ringer Tris-HCl 10 mM, pH 7,6. El primer dializado y el retenido se utilizaron para incubar ovocitos de cavidad (maduros desde el punto de vista nuclear) durante media hora. Los ovocitos se lavaron en Ringer 0,1 Tris-HCl 10 mM, pH 7,6 y se colocaron en 2,5 ml de Ringer y se inseminaron con 0,5 ml de suspensión de espermatozoides (1 testículo / 1 ml de Ringer 0,1).

Localización del factor pars recta | a Contenidos

   Si con las técnicas inmunológicas corrientes se preparan anticuerpos contra homogenados de pars recta , los anticuerpos generados inhiben el efecto de dicho homogenado sobre los ovocitos. En efecto, tal como se puede observar en la Tabla 30, si ovocitos previamente condicionados con pars recta son tratados con suero anti pars recta se observa una significativa inhibición de los porcentajes de fecundación. Los controles realizados con suero de animales no tratados no presentaron inhibición. Por otra parte, el tratamiento de los ovocitos cavitarios con homogenados de pars recta conjugados con isotiocianato de fluoresceína permitió localizar la fluorescencia en la membrana vitelina ().

Tabla 30
Accion del suero anti pars recta sobre la fecundidad de los ovocitos condicionados
Pre - incubación	Ovocitos fecundados ( % )
Suero normal	46,4 ± 2,6
Suero anti pars recta	0,0 ± 0,0
Ovocitos condicionados se trataron con suero normal y suero anti pars recta durante 2 horas. Luego del tratamiento, los ovocitos se lavaron con Holtfreter 0,1 y se inseminaron en condiciones similares a las descriptas en la Tabla 25.  n=5

   El conjunto de las observaciones descritas en esta sección nos induce a suponer que la modificación de la membrana vitelina o su "maduración" por los factores del oviducto (para emplear el termino acuñado por Schuetz) es uno de los pasos que sigue el ovocito para asegurar se fecundación. Poco conocemos acerca del mecanismo de acción de este factor, las evidencias con anticuerpos y homogenado marcado indican que el mismo se pega a la membrana vitelina pero desconocemos todavía si un mecanismo enzimático está envuelto en este proceso.