Introducción a la Virología

Parvovirus

Steve Dewhurst, Associate Professor of Microbiology and Immunology, University of Rochester  Medical Center USA.
Traducido por Néstor Núñez Acevedo MD. Gyn&Obst. Málaga. España

Parvovirus: Conceptos básicos

REFS: Berns K., Fields Virology, 3rd Edition, Ch. 69; Young NS, Fields Virology, 3rd Edition, Ch. 70 (general)
Parrish, C. Sem. Virol. 5:121, 1994 (evolution); Cotmore and Tattersall, Sem. Virol. 6:271, 1995 (replication)
Parrish, C. Sem. Virol. 5:121, 1994 (evolution); Cotmore and Tattersall, Sem. Virol. 6:271, 1995 (replication)

Los parvovirus comprenden 2 subfamilias:

1. Parvovirinae, que infectan a los vetebrados
   • Parvo-virus: parvovirus animal autónomo , incluyen los parvovirus canino, felino, murino
   • Eritro-virus: parvovirus animal autónomo, el parvovirus B19
   • Dependo-virus: requiere la coinfección con un virus colaborador para reproducirse; ejemplos: el  virus type 2 adeno-asociado (AAV2, llamado de modo más sencillo: AAV)
2. Densovirinae, que infectan a los insectos (mosquitos,mariposas),

Propiedades

• Físicas: Son pequeñas (approx. 20 nm de diámetro) cápsides icosaédricas, compuestas por 3 proteínas víricas muy estables. Por eso los parvovirus son estables en medios ácidos y alcalinos (pH 3-9), y resisten altas temperaturas (incubarlos a 56 Cº x 1 hora no disminuye su infectividad).
• Genómicas: Los parvovirus contienen cadenas simples lineares de DNA con un tamaño aproximado de 5 kb. En la mayoría de los casos (pero no siempre), la cadena que es empaquetada es complementaria del mRNA viral. El genoma tiene abundantes secuencias GC en cada terminal que son verdaderos palindromos (se leen de mismo modo de derecha a izquierda que de izquierda a derecha),  tienen tamaños variables que van de 100-300 nucleótidos y pueden plegarse sobre sí mismos para formar estructuras parecidas a las horquillas del pelo. En la mayoría de los casos, las secuencias terminales son diferentes en los finales 5'- y   3'- del genoma, aunque hay excepciones como en el caso del parvovirus B19 donde ambas secuencias termini son idénticas, y en el caso del AAV (el AAV tiene una secuencia de repetición invertida en el final del genoma). La importancia funcional de estos palindromos terminales es que contienen secuencias cis-activas que regulan la replicación y enpaquetamiento de los genomas de los parvovirus.
• Biológicas: Los parvovirus se replican en el núcleo. Lo mismo que otros virus pequeños de DNA (como los papilomavirus), necesitan que la célula pase por la fase S para poder replicar su DNA Pero a diferencia de los papilomavirus, los parvovirus son tan pequeños y tan simples que no tienen el poder de forzar a la célula de entrar en el ciclo celular (como podría ser, uniéndose a las proteínas regulatorias del ciclo celular). Por eso los parvovirus autónomos se replican únicamente en células que se dividen rápidamente. Hay que anotar que los dependovirus, como el AAV2 son aún más dependientes de los factores intracelulares, porque necesitan que sus células huésped sean infectadas por un virus  colaborador (usualmente un adenovirus ó el virus del herpes simple).

Nota 1: Los AAV tienen 3 promotores, sin embargo los parvo B19 tienen solamente uno.
Nota 2:los  parvo B19 tienen un lugar adicional polyA interno.  

Productos genéticos de los Parvovirus

• Palíndromo terminal TPs: Es el origen de la replicación del DNA. Tamién, el TPs permite la encapsidación (empaquetamiento) del DNA viral. En el AAV las secuencias repetidoras terminales invertidas (ITRs) son importantes para la integración en los cromosomas.
• Proteínas del gen/NS rep (regulatory proteins): son proteínas regulatorias (o no estructurales). El NS1 es un activador trans de la expresión genética viral (el NS2 también regula la expresión genética viral). Otras funciones del NS1 incluyen actividades asociadas con la replicación del DNA viral, como las funciones de la endonucleasa y la de la helicasa.
• Proteínas del gen/VP cap (capside): son proteínas estructurales que forman la cápside (los parvovirus no tienen envoltura).

Biología de los Parvovirus

Parvovirus autónomo: Generalidades

• estos virus se reproducen en células que se dividen rápidamente. A diferencia de otros virus pequeños de DNA como los papilomavirus, que pueden unirse e inactivar las proteínas del ciclo regulatorio celular, como la P53 (y haciéndolo así envía a la célula a la fase S), los parvovirus no pueden estimular a las células para que comiencen a sintetizar  DNA. Lo que puede explicar su predilección por las células que se dividen rápidamente (como son los precursores de los eritrocitos en el caso del  parvovirus B19) y por los mamíferos en su estado fetal. (como las infecciones congénitas de los gatos con el virus de la panleucopenia que les puede causar ataxia cerebelosa debido a la destrucción celular, cuando el cerebelo está en desarrollo). Hay que resaltar que no todas las células que se dividen rápidamente son susceptibles de ser infectadas por los parvovirus, ya que los receptores celulares para los parvovirus autónomos tienen una distribución restringida. Así el receptor del parvovirus B19 es la globosida (antígeno P del grupo de sangre), el cual solo se encuentra en escasas células (como pueden ser los precursores de los hematíes).
• Los parvovirus autónomos pueden causar infecciones asintomáticas, lo que sugiere un nivel muy bajo de replicación en el huésped. No está claro si se acompaña  de la integración del genoma del parvovirus en los cromosomas de la célula huésped, como ocurre con el AAV
• Los parvovirus autónomos pueden inhibir la formación de tumores en los animales de laboratorio.Puede deberse a que la replicación en las células tumorales es destructiva (ya que son células poco diferenciadas que se dividen rápidamente).

Parvovirus autónomo específico:

• Parvovirus felino (FPV =Feline ParvoVirus) . varios virus componen este grupo. Atacan a varias especies de animales, produciendo enfermedades severas en ellos (felinos, caninos).
• Parvovirus Canino (CPV = Canino Parvo Virus), es un ejemplo muy informativo e interesante de una infección emergente. Se detectó por 1ª vez en 1978 como un patógeno nuevo de los perros (causa diarrea e fallo cardíaco en peros jóvenes). Se propagó globalmente. En 1981, la cepa original (tipo 2 del CPV) fué completamente reemplazada por una variante (el tipo 2a ). Volvió a ocurrir en1984-1990, cuando fué reemplazado por el tipo 2b. sorprendentemente, los CPV-2a y CPV-2b difieren solamente en un 2% a nivel genético, y sin embargo el CPV-2b reemplazó al CPV-2a en todo el mundo. Parece ser que una nueva cepa de FPV apareció en 1978, con la habilidad de infectar a los perros, sufrió mutaciones y el nuevo virus, el CPV, pasó por un rápido proceso de adaptación a su nuevo huésped, y tuvo cambios específicos que le habilitaron para infectar y  replicarse más eficientemente en su actual huésped, el perro.
• Parvovirus B-19. Es el principal parvovirus importante para los humanos.Fué descubierto en 1974 y se propaga por vía respiratoria. cerca del 60% de los adultos son B-19+. El virus se reproduce en las células progenitoras de los eritrocitos porque utiliza el globósido (antígeno P del eritrocito) para entrar en las células. Este receptor  se encuentra en las células progenitoras de los hematíes, en los miocitos del corazón y  en muy pocas células más.Lo que explica mucho la enfermedad que produce el B-19. Sin embargo, la presencia del B-19 en una célula no la hace necesariamente susceptible al B-19, ya que la permisividad de la célula también depende del procesado del mRNA viral.ver a continuación.

Imagen del parvovirus canino

Patogénesis de la infección por el B-19 Se propaga probablemente por vía respiratoria. Una fase intensa de viremia aparece a la semana de la primoinfección y está marcada por la presencia de entre 10 a la 8 potencia y de 10 a la 14 potencia (!) de copias del genoma de DNA del B19 x ml de plasma.!!!
Durante esta fase de viremia el virus puede cruzar la barrera placentaria e infectar al feto. 10 días después de la infección, los depósitos de los  precursores de los eritrocitos de la médula ósea están vacíos y los anticuerpos empiezan a producirse. Como es de esperarse, comienza la formación y depósito de complejos inmunes que producen eritema y artralgia/artritis hacia la tecera semana de la primoinfección. Hay algunos raros individuos que no expresan el globósido y son resistente a la infección por B-19

Las enfermedades humanas más importantes asociadas al B-19 son:

• Eritema infeccioso (ó quinta enfermedad). Afecta a niños y adultos. Es generalmente moderada (e inclusive puede ser asintomática). Los signos clásicos son: un intenso eritema, que empieza en las mejillas y se propaga al resto del cuerpo (también se le llama eritema de la cara golpeada). Puede acompañarse de artritis/artralgias pasajeras debido al depósito de complejos inmunes en las articulaciones (el componente articular se ve más en los adultos). Hay que recordar de que debido a que los signos clínicos se deben a la formación y depósito de complejos inmunes, la presencia de virus en la sangre es muy escasa cuando se declara la enfermedad.
• Crisis de aplasia pasajera. En personas que tienen anemia, una infección aguda por el B-19 puede causarle serios problemas debido al cese de la producción de hematíes por la médula ósea. Alguien con anemia de células falsiformes ó con otra enfermedad genética que afecte a los hematíes, puede tener problemas, ya que la vida media de los hematíes defectuosos es más corta. Las transfusiones pueden ser usadas para tratar ésta crisis en éstas personas.
• Hydrops fetalis. La infección durante el embarazo puede producir una infección fetal y producir un hydrops fetalis con la consiguiente pérdida fetal por  anemia severa. El B-19 no parece causar malformaciones fetales.
• Infección crónica por B-19. En algunas personas la infección por B-19 es persistente. Parece que este fenómeno está asociado con el fallo de producir un anticuerpo neutralizante contra el virus 8cas siempre debido a un trastorno congénito ó adquirido de inmunodeficiencia, como el SIDA). El resultado es que no hay eritema ó artritis, pero el virus continua reproduciéndose y continúa su destrucción de precursores de hematíes. El fenómeno lleva a una aplasia medular pura de la serie roja, caracterizada por anemia intermitente. Puede tratarse por transfusiones y por administración de inmunoglobulina anti B19. Hay que resaltar que las infecciones fetales por el B19 pueden producir ocasionalmente  una aplasia medular pura de la serie roja.

Expresión de los genes del parvovirus B19

El B19 es diferente a los demás parvovirus autónomos porque usa un solo promotor y tiene un lugar polyA interno en la mitad de su genoma. La presencia de este lugar polyA interno significa que la producción de copias completas de mRNA del B19 depende en la habilidad de la lectura completa de este lugar interno polyA. este hecho da lugar a varias implicaciones según los variados huéspedes del B-19, ya que el lugar interno polyA es leído en su totalidad solamente en los eritrocitos, por lo que el B-19 se puede replicar solamente en éstas células. En contraste, en otros tipos celulares, no se producen copias completas del mRNA y por eso el virus es incapaz de reproducirse.

Los resultados del experimento de Liu y sus colaboradores son consistentes con el modelo siguiente de la expresión genética del B19

Dependovirus (virus asociado al adenovirus)

• Patogénesis. El AAV no estáasociado an enfermedades conocidas ni con el cáncer.
• Replicación: Se ha demostrado que requiere:
  • coinfección de la célula huésped con un virus colaborador, ya sea un adenovirus ó un herpesvirus.
  • exposición de las células a agentes tóxicos que dañen el DNA, como la luz ultravioleta ó los rayos gamma.
• Latencia. Cuando el AAV infecta las células en ausencia de un virus colaborador ó de agentes tóxicos, el virus no se replica y se integra en el cromosoma del huésped. esta integración ocurre, de modo preferente, cerca del terminus q del cromosoma 19 y causa una latencia viral. La integración se hace por una recombinación no homóloga entre las secuencias de los repetidos terminales invertidos (ITRs = inverted terminal repeats) del AAV y las secuencias localizadas en el cromosoma 19. Es interesante que, en la región del cromosoma en la cual se integra el AAV tiene una copia del sitio de unión ([GCTC]3) del DNA del AAV Rep. Parece que el AAV Rep es capaz de unirse a este sitio además de unirse al lugar AAV-ITR. Por el contacto simultáneo con el DNA del AAV y el DNA del cromosoma, parece que Rev tiene una afinidad específica por el cromosoma 19. Después de la integración, AAV puede ser reactivado de su estado latente por una infección por un virus colaborador.
• Quedan muchas incognitas acerca de la integración del AAV.
  • No se sabe como el genoma viral inicial, formado por una cadena simple de longitud igual a la unidad, se conviete en un genoma tándem bicatenario con uniones cabeza-cola dentro del DNA de la célula.
  • No está claro cómo se reactiva el AAV de su lugar en el cromosoma 19, aunque parece que el AAV-Rev  es necesario para la reactivación, lo mismo que el sitio de resolución terminal (TRS = terminal resolution site), localizado dentro de los repetidos terminales invertidos. (vea el diagrama que muestra la replicación del AAV). Una teoría es que el AAV-Rep corta el DNA viral integrado en el sitio TRS y libera una copia intacta del genoma viral del genoma integrado en tándem cabeza-cola.
• Funciones de colaborador. Los agentes físico-químicos que dañan al DNA, los mismo que las proteínas específica de los virus colaboradores, como son los productos genéticos E4 de los adenovirus, promueven una segunda  síntesis  de cadena por el AAV (como es la conversión del genoma ss-DNA viral a la forma ds-DNA). La síntesis de una segunda cadena es la llave que controla y limita la frecuencia de replicación del AAV y su expresión genética, en gran medida porque la forma ds-DNA del genoma AAV es:
  • factor intermedio en la replicación del DNA
  • también es una plantilla para la transcripción del mRNA viral
  • Esta observación ha llevado a los investigadores a concluir que las funciones de colaborador pueden promocionar la replicación del AAV, al menos en parte, estimulando la reparación del DNA celular dañado. Este proceso ocurre antes de que la célula entre en la fase S y se presume que comprende alteraciones en la disponibilidad de la expresión de las polimerasas DNA celulares que el AAV puede usar para la síntesis de una segunda cadena.

Del experimento que se muestra a continuación, surge la evidencia de que la proteína AAV-Rep puede unirse al DNA del palíndromo terminal del AAV y al sitio de integración Õ   viral en el cromosoma 19.

Replicación  del  DNA  de los Parvovirus

Replicación del DNA del AAV  Ya que existen muchos factores que estimulan la replicación del AAV facilitando la síntesis de DNA de una segunda cadena, es importante entender el actual modelo de la replicación del AAV

Primero: vale la pena recordar algunos conceptos básicos en la replicación del DNA

Las propiedades de los enzimas importantes identificados en el esquema superior son:

• Endonucleasa: hace un corte en el DNA, permitiendo que entre la helicasa.El  AAV rep puede hacerlo.
• Helicasa: Funde la doble hélice que está unida por puentes hidrógeno, necesita ATP.  AAV rep puede hacerlo.
• Topoisomerasa: Desenrolla de modo topológico el DNA empaquetado. No está claro si el  AAV rep puede hacerlo.

A continuación se hace una representación esquemática de la replicación del AAV

Todos los parvovirus usan una polimerasa DNA celular.

Recuerde que la replicación de los parvovirus autónomo es similar, pero algo más compleja debido a las diferencias en las secuencias terminales.

Vectores basados en el AAV

El AAV tiene interés como un vector para tratamientos génicos, en parte debido a las siguientes consideraciones:

• Los vectores AAV son muy estables y son débilmente inmunogénicos. Interesantemente, AAV es tan pobremente inmunogénico que se pueden reinfectar monos con el mismo vector sin provocar una respuesta inmune anti viral exagerada.. Puede deberse en aprte a que los vectores AAV no expresan proteínas virales después de han entrado en las células diana (ver más abajo).
• Los vectores AAV son capaces de expresar genes en las células en reposo (si las células son expuestas a agentes tóxicos físico-químicos que dañen el DNA). NOTA: algunos agentes químicos que dañan el DNA, como la hidroxiurea, se toleran muy bien, son poco tóxicos y se han usado por años en el tratamiento de la anemia de células falsiformes.
• Los vectores AAV son capaces, teóricamente, de una integración cromosómica específica de lugar. Esto podría permitir la expresión por mucho tiempo de genes expresados a su vez por los vectores AAV, sin el riesgo de una mutación por inserción, que puede contribuir a una oncogénesis retroviral.

Se han fabricado dos tipos de vectores:

• vectores donde el gen cap se ha borrado y reemplazado por el gen deseado
• vectores en los cuales se ha borrado todo el genoma AAV, excepto por los repetidos terminales (los cuales son necesarios para la replicación del genoma y para su integración y reactivación).

El primer tipo de vectores expresan Rep y se cree que son capaces de integración cromosómica específica de lugar. tienen la gran desventaja de que solo pueden almacenar approx. 2 kb de DNA extraño

El segundo tipo de vectores se usa más ampliamente, ya que pueden almacenar hasta 4.5 kb de DNA extraño.Estos vectores se integran usualmente de modo no específico (porque presumiblemente no tienen Rep) y se integran con gran frecuencia, por encima del 50% en las células infectadas.

Los vectores AAV se usan actualmente para el tratamiento génico de la fibrosis quística y se están probando en otros entornos. El problema principal de estos vectores es:

• capacidad limitada de almacenamiento del DNA extraño (debido al tamaño tan pequeño del genoma del AAV)
• el AAV requiere un virus colaborador para que pueda replicarse,
• el AAV se replica a niveles muy bajos, lo que significa que los títulos virales son pequeños.

Preparación de vectores. los vectores AAV defectuosos (tanto los de tipo 1 (cap borrado) como los de tipo 2 (con rep y cap borrados) se usan para producir partículas infecciosas de AAV y se "transfectan" en células especiales que expresen el AAV cap+rep (y de este modo complementen los genes ausentes de los vectores defectuosos). Estas células especiales se infectan con un virus colaborador (adenovirus). El adenovirus se usa para permitir que el AAV se reproduzca, y las partículas AAV son entonces purificadas  de los adenovirus por medio del calor (el AAV es estable al calor y el adenovirus no lo es), se separan las partículas virales intactas de la basura celular usando el cloruro de cesio en un gradiente de densidad.

Uso in vivo. Los vectores AAV se introducen tal cual en los pulmones ó en los tejidos diana y se deja que infecten las células. Hoy en día hay interés en usar:

• sustancias químicas que dañen al DNA
• adenovirus defectuosos (E4+, con otros genes borrados) para aumentar la eficiencia de la transducción de los genes del AAV in vivo

Vectores de los parvovirus autónomos. Hay también interés en el desarrollo de sistemas de vectores de parvovirus autónomo, basados en el B19. estos trabajos han empezado más recientemente que el de los vectores AAV, pero busca tomar ventaja de la estabilidad de los parvovirus, usándolos como plataformas para el diseño de vacunas estables al calor.

Específicamente, uno puede incorporar epítopos antigénicos (hasta 227 aa) en una región externa de la proteína VP1 del B19, sin interferir en el ensamblaje de la cápside, y de ese modo generar partículas recombinantes B19 que puedan expresar antígenos extraños en su superficie (Miyamura et al. PNAS USA 91:8507, 1994).

NOTA  IMPORTANTE

Actualizado 1/97, Steve Dewhurst, Associate Professor of Microbiology and Immunology
© Copyright University of Rochester and Stephen Dewhurst, October 1996

URL: http://www.urmc.rochester.edu/smd/mbi/grad2/parvo97.html