II. - El Polémico Agente Infeccioso

Las infecciones víricas lentas supusieron el descubrimiento de un nuevo agente infeccioso con unas propiedades físico-químicas y un comportamiento biológico muy diferente del resto de los microorganismos. En 1977, en un trabajo publicado en Science [19], Gajdusek describe algunas de las propiedades no convencionales obtenidas a partir de estudios del ``virus scrapie,'' transferido a ratones y hamsters. Entre ellas destaca su inusual resistencia a varios agentes químicos y físicos.

 

Algunas Propiedades Físicas y Químicas de los Agentes Infecciosos no Convencionales	Propiedades Biológica
Resistencia a: - Formaldehido - EDTA - Proteasas (Tripsina, pepsina) - Nucleasas (Ribonucleasas A y III, Desoxiribonucleasa I) - Calor (80°C) - Radiación ultravioleta (2540Å) Invisibles al microscopio electrónico	Largo periodo de incubación (meses, años, decadas) No producen respuesta inflamatoria Patología crónica progresiva Fatal en todos los casos Carecen de estructuras visibles al microscopio electrónico No antigénicos Carecen de cuerpos de inclusión Presencia de ácido nucleico no demostrada.

Debido a sus manifestaciones a nivel histológico, las enfermedades atribuídas a virus lentos se clasificaron como encefalopatías víricas subagudas espongiformes. La lesión neurohistológica básica en todas ellas es una progresiva formación de vacuolas en dentritas, en axones y cuerpos de neuronas. Otra característica distintiva de las infecciones por virus lentos es la ausencia de respuesta inflamatoria en el cerebro. Más aun, no hay evidencias de la existencia de respuesta inmune alguna frente a los átipicos agentes infecciosos. Otra característica, que desconcertó a los investigadores, fue la imposibidad de reconocer las estructuras víricas en secciones de cerebro observadas al microscopio electrónico.

Para Gajdusek y sus colaboradores la resistencia del agente infeccioso de scrapie a radiación ultravioleta de 254 nm no supuso una prueba de la no existencia de información genética en forma de una molécula de ácido nucleico, ya que los viroides demostraron una resistencia similar en preparaciones crudas de plantas. Por otra parte, encontraron suficientes propiedades víricas clásicas en los nuevos agentes infecciosos como para seguir clasificándolos como virus.

Las mencionadas técnicas se aplicaron a homogenados 
de cerebro, fracciones microsomales, preparaciones de 
placas amiloides y complejos detergente-lípido-proteína.

En vista de los resultados, Prusiner introdujo el término de prion (``Proteinaceous infectious particle''), para diferenciar el nuevo agente infeccioso de otros agente patógenos como virus, viroides, bacterias, hongos o parásitos. Los priones fueron definidos como partículas proteicas carentes de ácidos nucleicos.

Poco tiempo después se descubrió que los priones de scrapie contienen una proteína hidrófoba proteasa-resistente de 27-30 kD, constituída por una única cadena polipeptídica. Se la denominó proteína PrP (``prion protein''). La proteína se acumula progresivamente en los cerebros infectados durante el curso de la enfermedad. También se identificaron placas amiloides compuestas por fragmentos de PrP. Por otra parte se descubrió que los nivels de mRNA PrP son similares en celebros de hamsters sanos e infectados por scrapie, por lo que el acúmulo de PrP no puede deberse a un incremento en la velocidad de síntesis de la proteína. El mecanismo de acumulación de PrP aún sigue constituyendo una incógnita.

Con el hallazgo de PrP, surgió la pregunta de dónde se encuentra el gen codificante para PrP (o gen PRP). La clave para resolver el nuevo problema fue la identificación, en 1984, de unos 15 aminoácidos de uno de los extremos de PrP. Dicha secuencia permitió a diversos investigadores la construcción de sondas capaces de indicar la localización exacta del gen PRP.

El gen fue finalmente hallado en el lugar que los partidarios de la teoría del prion menos esperaban: en el genoma del hospedador. Mediante pruebas diseñadas por el equipo de Hood, B. Oesch pudo demostrar que las células de hamster contienen un gen PRP en su genoma. Posteriormente se hallaron genes PRP en los cromosomas de todas las especies susceptibles a contraer ESET. En el caso del hombre, en el brazo corto del cromosoma 20. Una posible explicación era que el gen PRP debía expresarse únicamente en los individuos afectados por las enfermedades. Sin embargo, se pudo comprobar que PrP se encuentra presente, de forma natural, en células de organismos sanos. Una primera interpretación hizo pensar en una gran equivocación a la hora de considerar la proteína PrP como el elemento esencial del carácter infeccioso y patogénico de los priones. Pero, sorprendentemente, se descubrió que la proteína PrP presente en los organismos sanos es proteasa-sensible, mientras que la proteína PrP de los organismos afectados por la enfermedad es proteasa-resistente.

La proteína PrP normal proteasa-sensible y la proteína PrP patogénica proteasa-resistente, se denominaron PrPsen (o PrPc = proteína celular) y PrPres (o PrPsc = proteína scrapie) respectivamente. Análisis estructurales pusieron de manifiesto que la proteína PrP celular posee una estructura en hélices alfa, mientras que la proteína PrP anormal presenta mayor proporción de láminas beta. Ambas proteínas son codificadas por el mismo gen y poseen idéntica secuencia de aminácidos. Sin embargo, su conformación tridimensional es distinta, en clara contradicción con el enunciado del Dogma Central de la Biología de J. Monod: ``La secuencia de aminácidos determina de manera unívoca la estructura terciaria de las cadenas polipeptídicas.''

La existencia de los dos tipos de proteína PrP y el mecanismo que da origen a la forma patogénica, así como la capacidad de PrPsc para acumularse, constituyen el núcleo del debate actual. Según la teoría de Prusiner, las PrPsc son capaces de inducir su estructura espacial a las PrPc o a sus precursores, lo cual explicaría el incremento de la concentración de PrPsc (Ampliado en el Capítulo IV).

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• II.4.- Hipótesis de las Moléculas Mixtas (Holopriones)

  C. Weissmann, en un trabajo publicado en Nature[49] en agosto de 1991, propone que el agente infeccioso esta compuesto por dos componentes. Uno de los componentes es la proteína PrPsc (o apoprion), capaz de causar enfermedades transmisibles incluso en ausencia de ácidos nucleicos. El otro componente (o coprion) contiene las propiedades fenotípicas que definen el linaje del agente infeccioso (o holoprion). Se ha propuesto que el coprion es un ácido nucleico (DNA o RNA), por ser transmisible y mutable.

  Weissmann sugirió que los ácidos nucleicos que constituyen copriones potenciales están normalmente asociados a PrPsc, pero que también pueden estar presentes de manera independiente en las células de individuos no infectados. Esta hipótesis implica que los copriones no son esenciales para la patogénesis ni la propagación.

  Según el modelo del holoprion, PrPsc sería capaz de propagarse por la conversión de PrPc (o de precursores formados a partir de PrPc) en copias de si misma, mediante modificaciones covalentes o cambios conformacionales mediados por PrPsc o por el holoprion. Una vez que el holoprion ha penetrado en una célula, su coprion puede ser replicado por polimerasas celulares, proceso estimulado por la presencia de PrPsc. El nivel de holopriones en el citoplasma crece a medida que las PrPsc de nueva formación se van uniendo a los copriones sintetizados por las polimerasas.

  En la segunda parte de su modelo de propagación, Weissmann intenta explicar por qué las preparaciones del agente infeccioso son resistentes a nucleasas y a radiaciones. Weissmann afirma que el carácter infeccioso y patogénico del holoprion radica en la proteína PrPsc, de acuerdo con la propuesta de Prusiner y sus colaboradores. Es decir, la destrucción del coprion no elimina el efecto infeccioso de un extracto de tejido contaminado. Si una molécula de PrPsc que ha perdido su coprion original penetra en una célula, puede (pero no necesariamente) reclutar un ácido nucleico que le sirva como coprion. El holoprion resultante posee propiedades fenotípicas que difieren de las del holoprion original.

  En 1994 Weissmann publica en Science [50] una actualización de su modelo. En esta ocasión sugiere que en las células neuronales normales, PrPc es transportada hasta la superficie celular, de donde es endocitada y probablemente reciclada. Por infección de PrPsc, las PrPc son convertidas en PrPsc en la superficie celular o en el interior de las vesículas de endocitosis. La gran estabilidad de PrPsc se presenta como el determinante de su acúmulo en la célula.

• II.5.- Hipótesis Víricas

  El hecho de que la hipótesis del prion no haya proporcionado respuestas convincentes a muchas cuestiones básicas, ha llevado a diversos investigadores a retomar la hipótesis del virus lento. Así, para L. Manuelidis el argumento de que debe descartarse que el agente infeccioso sea un virus, debido a su insólita resistencia a las radiaciones ionizantes y ultravioletas, no es válido. De hecho, existen virus conocidos que disponen de un sistema de reparación del material genético que les permite resistir niveles de radiación similares. La falta de respuesta inmune también puede ser justificada, ya que existen virus lentos convencionales que escapan al sistema inmune instalándose en el interior de las células.
  

  La hipótesis vírica de Manuelidis no implica que PrP no desempeñe un papel esencial en las enfermedades. Sin embargo, en este caso se le atribuyen funciones distintas que en la hipótesis defendida por Prusiner y sus colaboradores.

  Manuelidis hace especial hincapie en varias características de los agentes infecciosos, a saber:
  

  - La existencia de distintas cepas
  - Su multiplicación exponencial
  - Su tiempo de latencia prolongado
  - Infección del sistema retículo -endotelial (bazo, glóbulos blancos)
  
  Como en otras infecciones víricas, un cambio en un gen del hospedador modificaría la capacidad del virus lento para infectarlo. Es decir, los polimorfismos y las mutaciones del gen PRP podrían estar ligados a una mayor susceptibilidad del hospedador frente a ciertas cepas del agente infeccioso.

  Para los partidarios de la hipótesis vírica, la epidemia BSE constituyó una prueba a favor: al quedar sobradamente demostrada la transmisión por vía oral, cabe preguntarse cómo resiste un agente puramente proteico la acidez y el ataque de las enzimas en el aparato digestivo. En cambio, muchos virus sí son capaces de sobrevivir a estas condiciones. Manuelidis sugiere que, como el virus de la polio, el agente infeccioso es transportado desde el intestino delgado por los glóbulos blancos hasta el bazo, donde puede permanecer latente durante 5 a 20 años. Este razonamiento no es válido para un agente de naturaleza puramente proteica.

  Utilizando un nuevo método de purificación, H. Diringer halló en 1994 lo que parecía ser la primera evidencia física de la existencia de los virus. Su tamaño era inesperadamente pequeño: 10 a 20 nm. Ante la dificultad de aislar las partículas víricas, Manuelidis argumenta que una partícula provista de un ácido nucleico y proteínas de protección puede no ser visible. Aproximadamente un año después, el equipo de Manuelidis obtuvo un gel de electroforesis con bandas que revelaban la existencia de RNA en extractos cerebrales de hamsters con CJD. Las bandas no pudieron localizarse ni en cerebros no infectados ni en las librerias genómicas, por lo que fueron consideradas candidatas a secuencias víricas. El tamaño de la partícula infecciosa fue evaluado en unos 27 nm, tamaño similar al de varios virus conocidos. El genoma se estimó en 1.000-3.000 pares de bases (retrovirus típicos: 10.000 pb; virus de la hepatitis B: 3.500 pb; virus de la hepatitis C: 1.000 pb).

  Los resultados publicados a mediados de 1995 por Manuelidis et al. en Proc. Natl. Acad. Sci. USA [26], constatan que, eliminando el 95% de la PrP de las partículas infecciosas de CJD con SDS 1%, éstas mantienen su carácter infeccioso. En cambio, su tratamiento con Gdn-HCl 6 M, disminuye el nivel infeccioso en más del 99.5%. Los investigadores concluyen que un ácido nucleico y una o varias proteínas constituyen los componentes intrínsecos del virus CJD. Los dos componentes no son infecciosos, a menos que se asocien en partículas nucleasa-resistentes con un tamaño de 120S y un diámetro de unos 30 nm. Los componentes parecen formar un complejo independiente de IAP, tal como indica el hecho de que conserven su carácter infeccioso tras ser sometidos a SDS 1%.

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