METODOS DE ESTUDIO Y DIAGNOSTICO VIRAL

Los métodos utilizados para reconocer las infecciones por virus humanos pueden clasificarse en DIRECTOS e INDIRECTOS, según persigan demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antígeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos específicos por parte del huésped en el curso de la infección.

Gran parte de las técnicas utilizadas en el diagnóstico clínico se basan en pruebas serológicas que identifican anticuerpos específicos frente a diversas proteínas antigénicas. Sin embargo, existen circunstancias en las cuales son necesarias pruebas que detecten precozmente la infección viral (tratamientos específicos, medidas profilácticas, etc.).

En algunas infecciones virales es posible detectar la presencia de antígenos virales previamente al desarrollo de la seroconversión, siendo esta prueba la única evidencia de la exposición al virus cuando no existe aumento de los niveles de anticuerpos circulantes (pacientes inmunodeprimidos).

Igualmente la detección del genoma viral puede favorecer la precocidad del diagnóstico viral y su confirmación. En la última década se han desarrollado una serie de técnicas para el diagnóstico viral basadas en la detección de ácidos nucleicos. De ellas la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es la más utilizada.

En el momento actual, la tendencia en el diagnóstico virológico consiste en emplear nuevas y más sensibles tecnologías de detección de antígenos y de investigación de ácidos nucleicos con el propósito de lograr un diagnóstico viral más rápido. El desarrollo de quimioterapia antiviral efectiva es responsable de esta tendencia que hace de la identificación rápida, sensible y específica de los virus, una necesidad.

Son aquellos que detectan:

1. El virus como agente infeccioso (aislamiento viral).

2. La presencia de antígenos virales (técnicas inmunológicas): Inmunofluorescencia (IF), Enzimoinmunoanálisis (EIA), Test de Aglutinación.

3.La presencia de ácidos nucleicos virales (PCR, etc.).

4.El virus como partícula viral (microscopía electrónica).

La base del diagnóstico viral es la detección del virus o de sus componentes. El aislamiento del virus era la técnica standard de oro sobre la cual se medían todas las otras pruebas de diagnóstico viral, pero hoy en día con el desarrollo de las nuevas técnicas de Biología Molecular ya no es la más sensible. De igual forma el aislamiento de virus tiene una sensibilidad y una especificidad muy alta. Debido a que sólo se amplifica el virus, se aumenta la sensibilidad sin disminuir la especificidad. Sin embargo, existen algunas desventajas en el aislamiento del virus: El proceso suele ser lento, ya que demanda días a semanas para la identificación, y en consecuencia puede no estar disponible a tiempo para influir en la atención del paciente. Además, es un proceso laborioso y caro. Por otra parte requiere el uso de sistemas de cultivos adecuados, por ejemplo, se necesitan varias líneas celulares para la detección óptima de virus.

Los cultivos celulares son, pues, los biosubstratos más corrientemente empleados para la propagación de los virus.

Un cultivo celular es obtenido, de explantes de órganos o de embriones de animales.

Estas células obtenidas asépticamente se disocian tratándolas con una enzima (tripsina) que rompe el cemento intercelular. La suspención de celulas libres así obtenidas se coloca en la superficie plana de un recipiente de vidrio o plástico en donde las células se adhieren y multiplican formando una fina capa de células que se llama MONOCAPA CELULAR.

Esta monocapa de células crece en un medio de cultivo complejo que contiene albúmina, vitaminas, sales, glucosa, etc., en un sistema buffer. Se previene la contaminación bacteriana adicionándole al medio antibióticos adecuados.

Los cultivos celulares en monocapa son los más usados, aunque hay otros sistemas (cultivos en suspensión, explantos, cultivos de órganos, cultivos en microcarriers, etc.).

Los cultivos celulares se dividen en:

Cultivos Primarios: Se obtienen a partir de células, tejidos u órganos tomados directamente del organismo y pueden subcultivarse una o dos veces.

Líneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo correspondiente a la especie de que provienen.

Líneas Celulares Continuas: Permite un número finito de subcultivos y son heteroploides. Para considerar que se ha logrado establecer una línea continua, esta debe de haber sido subcultivada por lo menos 70 veces. Las líneas celulares continuas ofrecen las siguientes ventajas:

Los distintos cultivos celulares varían en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya que existe una relación específica huésped-virus, y es en función de los datos clínicos y del tipo de muestra que se elige el cultivo para inocular el material.

Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37º C por un período de hasta 14 días promedio, esperando la aparición de efecto citopático, toxicidad o degeneración celular, observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan cultivos celulares no inoculados para control y comparación con cualquier cambio morfológico observado en los cultivos inoculados. El efecto citopático es la visualización de cambios morfológicos más o menos característicos en las células inoculadas producidas por la acción del virus sobre el cultivo celular.

Cuando los virus no producen efecto citopático, se puede recurrir a técnicas que ponen en evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las más usadas son: hemadsorción, hemaglutinación y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver 2)

Hemadsorción: Hay virus que durante su multiplicación intracelular, expresan en la membrana de la célula huésped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoproteínas capaces de unirse a receptores específicos en la membrana de glóbulos rojos de diferentes especies animales. De modo que si se agregan glóbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede poner en evidencia la infección de esas células a través de la unión de los glóbulos rojos a la superficie celular.

Hemaglutinación: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el sobrenadante de los cultivos utilizando el mismo fundamento que para la hemadsorción.

Las siguientes técnicas inmunológicas pueden utilizarse tanto para la detección de antígenos (métodos directos), como de anticuerpos (métodos indirectos). En el caso de detección de antígenos, se utiliza un anticuerpo específico antiviral (por lo general IgG) a cuya fracción Fc se ha conjugado una molécula marcada, que puede ser isotiocianato de fluoresceína (Inmunofluorecencia), un isótopo radioactivo 125I o 131I (RIA), o una enzima: peroxidasa, fosfatasa alcalina, o biotina-avidina (EIA), para objetivar la reacción.

Para el procedimiento indirecto (detección de anticuerpos), se emplea un anti-anticuerpo marcado y la reacción se realiza sobre un cultivo celular infectado por el virus en estudio.

Es una de las técnicas más antiguas y de uso más difundido en el laboratorio clínico. El principio básico de la inmunofluorescencia directa . Muestras clínicas apropiadas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluoresceína que difunden a través de la membrana celular y se combinan con los antígenos víricos en el interior de las células. La reacción antígeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparición de fluorescencia de color verde manzana.

Esta técnica se puede utilizar para una identificación rápida del virus directamente sobre la muestra (por ejemplo: células eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofaríngeo), o se la puede emplear para la confirmación del efecto citopático observado en cultivos celulares.

 Sin embargo la realización de la reacción es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnóstico certero, así como una recolección y preparación de la muestra adecuada.

Aun así, el método, en manos de una persona con experiencia resulta útil para la identificación rápida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un diagnóstico etiológico en el curso de una jornada de trabajo. Además puede estudiar varias muestras simultáneamente.

El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha incrementado la especificidad y en algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta técnica requiere sólo 2-4hs, y se ha reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificación de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza A.

La tinción con inmunoperoxidasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la técnica de elección en algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este caso el anticuerpo monoclonal esta marcado con una enzima que requiere la adición de un substrato para evidenciar la reacción por un cambio de color que es visible micro y macroscópicamente.

El test de aglutinación es un método simple, de un solo paso, que a veces se usa para la detección de antígenos virales en muestras clínicas. Los ensayos de aglutinación, dependen de la fijación inicial de anticuerpos antivirales específicos sobre eritrocitos o partículas de látex. Luego este reactivo se incuba con la muestra clínica en la cual se investiga el antígeno y las partículas se aglutinan si el antígeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecíficas.

El test de aglutinación ha sido usado para detectar antígeno de Rotavirus en heces (el más importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus. Además es una técnica rápida y barata. También se la ha usado para detectar antígenos de Adenovirus.

Fue originalmente aplicado para identificar el antígeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y el anticuerpo anti-HBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad, pero la aparición de un método como el ensayo inmunoenzimático (EIA) con su mayor tiempo de conservación de los reactivos, su costo relativamente más bajo y la ausencia de residuos radioactivos, ha reemplazado las técnicas de RIA en la mayor parte de los casos de detección de antígeno viral.

Los EIA para la detección de antígeno se basan habitualmente en la captura del antígeno por anticuerpos específicos unidos a una fase sólida, en general el pocillo de una microplaca o una pequeña esfera de plástico. El antígeno viral presente en la muestra clínica se combina con el anticuerpo fijado a la fase sólida y el antígeno viral se detecta mediante la adición de otro anticuerpo específico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas varía. En la reacción con la peroxidasa el substrato es un peróxido capaz de oxidar un compuesto químico incoloro que en su forma oxidada tiene un color característico.

En el caso de la fosfatasa la desfosforilización es la responsable directa de la aparición del color. Por esta técnica se puede procesar gran número de muestras en forma rápida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotómetros especialmente diseñados, siendo entonces una técnica más objetiva. Fig. 2.

Las técnicas de estudio y diagnóstico que a continuación se presentan, constituyen una herramienta ingeniosa desarrolladas a partir de los estudios de la Biología Molecular.

Actualmente es posible extraer secuencias específicas de un fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restricción. Luego estas secuencias extraídas, se pueden desnaturalizar y marcar ya sea con una enzima o con un isótopo radioactivo. A estas cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman sondas de ácidos nucleicos. Hoy en día se están produciendo sondas de ácidos nucleicos sintéticas, con lo que se obtiene sondas de oligonucleótidos de muy alta especificidad que están disponibles comercialmente y son las más usadas en los laboratorios.

Es un ensayo de hibridación molecular con una sonda marcada. Las hibridaciones pueden ser: DNA-DNA, RNA-RNA y RNA-DNA.

Primero se trata a muestras con reactivos que solubilizan y desnaturalizan los ácidos nucleicos. Posteriormente se añade un DNA marcado, complementario del DNA del virus y se incuba en condiciones para que se produzca la hibridación. La muestra se pasa entonces por una columna que contiene un gel que separa la sonda ligada al DNA viral hibridado de la no hibridada.

Dependiendo de como este marcada la sonda, se detecta la hibridación: Si está marcada con un isótopo radiactivo se puede hacer una lectura en un contador gamma de manera que la cantidad de radiación medida en la columna es directamente proporcional a la cantidad de DNA viral presente en el suero problema o también se puede realizar la electroforesis del DNA hibridado con la sonda marcada en gel de poliacrilamida y detectar la radioactividad emitida por la sonda mediante la aplicación de una placa de rayos X (Autoradiografía). Si esta marcada con una enzima se detecta por una simple evaluación colorimétrica.

Una nueva técnica, llamada Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), fue desarrollada por Saiki et al., para incrementar el número de moléculas de DNA blanco en las muestras. Tiene una sensibilidad tan alta que puede amplificar una única molécula de DNA y una sola copia de genes puede ser extraída, de mezclas complejas de secuencias genómicas y visualizada como bandas diferentes en geles de agarosa.

La PCR es, por tanto, una amplificación de secuencias específicas del DNA. Se basa en la utilización de secuencias cortas de nucleótidos sintéticos llamados primers o cebadores, que se hibridan de forma especifica con cada una de las cadenas de DNA , previamente desnaturalizadas, llamadas moldes o templados. Para que la reacción tenga lugar se usa una enzima, Taq pol (ADN Polimerasa termoestable obtenida de la bacteria Thermus aquaticus) y deoxinucleótidos trifosfatos. La función natural de la DNA polimerasa consiste en reparar y replicar el DNA. Los deoxinucleótidos trifosfatos se necesitan como ladrillos para la construcción. El nucleótido al cual se una la polimerasa será complementario de la base en la posición correspondiente de la cadena templado. Se sintetiza así una cadena simple de DNA, complementaria y alineada a cada "primer ".

Se realiza una serie repetida de ciclos cada uno compuesto por 3 pasos básicos:

b. Acoplamiento de los primers, desciende la temperatura (entre 55ºC-72ºC).

c. Elongación del primers, aquí se eleva la temperatura a 72ºC permitiendo la incorporación de los deoxinucleótidos.

Mientras tanto se van deplecionando los primers y los deoxinucleótidos, y se van sintetizando nuevas cadenas de DNA. Al final se consiguen miles de copias de DNA del fragmento de DNA limitado por los "primers ". Los fragmentos de DNA así obtenidos se pueden identificar por varias técnicas: visualización en geles de agarosa o poliacrilamida mediante tinción con bromuro de etidio y examen con luz ultravioleta, o hibridación con una sonda marcada. La combinación de la PCR y las sondas de ácidos nucleicos marcadas promete ser el método más sensible para la detección e identificación de los virus.

Mediante el microscopio electrónico es posible observar la morfología de los viriones presentes en muestras clínicas. La limitación del método además del costo del microscopio, es que necesita de una alta concentración de viriones (aproximadamente 109 partículas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Esto hace que sea una técnica poco utilizada, más aún con el desarrollo de técnicas alternativas de utilidad similar.

 Si la concentración de virus en la muestra clínica es baja, y por tanto no visible directamente por microscopio electrónico, se pueden utilizar técnicas que aumenten la visualización, por ejemplo, la inmunoelectromicroscopía, que consiste en el agregado de anticuerpos específicos antivirales y la formación de agregados de partículas que son más fácilmente visibles que las partículas solas. Fig. 5.

Son aquellos que reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del huésped: . Detección de anticuerpos específicos antivirales por técnicas inmunológicas (EIA, IFI, WB, etc.).  Producción de anticuerpos in vitro.

En el curso de una infección varían las poblaciones de anticuerpos frente al agente infectante. En una primera fase la clase predominante suele ser IgM, mientras que con el transcurso del tiempo las IgM disminuyen hasta desaparecer o quedar a baja concentración residual y, en cambio, aumentan las IgG. La búsqueda de anticuerpos clase IgM es de utilidad para hacer diagnóstico de infección reciente en una sola muestra de suero extraída en el período agudo de la enfermedad. Este método se emplea para el diagnóstico de enfermedades como: Rubéola, Citomegalovirus, Hepatitis a virus A, etc.

La búsqueda de anticuerpos clase IgG en una sola muestra se utiliza como técnica de tamizaje, por ejemplo, para el diagnóstico de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH). Posteriormente los hallazgos positivos son confirmados en la misma muestra de suero por otra metodología.

La seroconversión es el aumento del título de anticuerpos cuatro veces o más observado en dos muestras pareadas de suero. La primera muestra se obtendrá en el período agudo de la enfermedad y la segunda, 15 a 21 días después de la primera, en el período de convalesencia.

La seroconversión es útil para establecer el diagnóstico retrospectivo, pero no para el diagnóstico temprano de una infección, puesto que debemos esperar al período de convalecencia para obtener la segunda muestra del suero.

Este tipo de diagnóstico es útil para estudios epidemiológicos.

Las diferencias de títulos deben ser mayores de cuatro veces para tener valor estadístico y se debería estudiar ambas muestras simultáneamente.

Las determinaciones serológicas también nos pueden informar sobre el estado inmune del paciente frente a muchas infecciones virales, como paperas, sarampión y rubéola, donde la presencia de anticuerpos específicos indica que el individuo ha estado expuesto previamente al virus y que es inmune para una nueva infección.

A veces el diagnóstico serológico tiene dificultades, por ejemplo: cuando se realiza en recién nacidos para identificar la causa de una infección congénita. La evaluación de los resultados en este caso es difícil porque los ensayos serológicos detectan ante todo IgG, y mucha de la IgG presente en el suero del niño provino de la madre por vía transplacentaria y no es posible diferenciar la IgG del niño de la IgG de la madre.

Tradicionalmente, el diagnóstico de las enfermedades virales congénitas se realiza mediante determinaciones seriadas de IgG en el suero. El descenso del titulo de anticuerpos indica que los anticuerpos eran maternos y que el niño no está infectado. El aumento en el título de anticuerpos indica que el niño esta produciendo anticuerpos y por lo tanto esta infectado. Sin embargo, hoy en día el diagnóstico serológico viral se ha simplificado con las nuevas técnicas que detectan IgM, ya que la detección de IgM específica en el suero del niño confirma que el niño está infectado, porque la IgM no atraviesa la placenta y por tanto no puede ser de origen materno.

A continuación, se describirán los métodos serológicos más comúnmente usados en el diagnóstico viral.

Los métodos tradicionales para el diagnóstico serológico de las infecciones virales incluyen: la neutralización, la inhibición de la hemaglutinación (IHA) y la hemaglutinación indirecta (HAI). La confirmación serológica de una infección aguda por cualquiera de estas técnicas tradicionales esta dada por un aumento de cuatro veces o mayor en el titulo de anticuerpos cuando se emplean diluciones al doble seriadas.

En los últimos años se han desarrollado nuevos métodos para la detección de anticuerpos virales, y en muchos casos han demostrado ser mejores que las pruebas tradicionales en términos de economía, sensibilidad, especificidad y rapidez.

La IFI, es un método rápido y confiable para la determinación de anticuerpos antivirales en el suero del paciente.  Se basa en la unión de anticuerpos antivirales presentes en el suero del paciente a los antígenos virales expresados en la superficie y citoplasma de células infectadas, que han sido fijadas a un portaobjeto de vidrio. Como control de especificidad se usan células no infectadas.

El procedimiento es el que sigue: Se incuba el suero del paciente con las células infectadas y no infectadas. Luego se realiza un lavado con PBS y se agrega posteriormente anticuerpo anti IgG humana conjugada con isotiocianato de fluoresceína. El isotiocianato de fluoresceína es una sustancia que se vuelve fluorescente a la exposición de la luz ultravioleta y emite una luz verde característica. El conjugado se unirá a los anticuerpos del paciente si la reacción es positiva, leyéndose la prueba en un microscopio de fluorescencia. La presencia de Ac se evidencia por la aparición de fluorescencia en el citoplasma y superficie de las células infectadas, mientras que las células control no fluorescen.

Los EIA indirectos se han aplicado de forma amplia en los últimos años al diagnóstico de anticuerpos virales.

Tiene las ventajas de ser un método versátil, relativamente económico, sensible y de lectura objetiva (instrumental).

La metodología es la siguiente: Los antígenos virales se inmovilizan sobre una fase sólida (esferita, policubetas para microtitulación u otros elementos de plástico) y se agregan los sueros en estudio; se incuban, se lavan y se revela la reacción Ag-Ac por el agregado de una inmunoglobulina antiespecie conjugada con una enzima, seguida por el substrato apropiado para esta. Los resultados se pueden leer con un espectrofotómetro y en algunos casos de forma visual.

El fundamento y el procedimiento de esta técnica ya fue descripto para el estudio de Ag viral (método directo).

Ahora lo que buscamos es detectar anticuerpos antivirales, por eso se usan partículas de látex recubiertas con Ag viral. Fig. 8.

Las técnicas inmunológicas de Inmunoblot están encontrando amplias aplicaciones en el diagnóstico virológico. Son particularmente útiles para el diagnóstico del HIV.

La técnica de WB se basa en la separación electroforética de proteínas virales que son posteriormente inmovilizadas en papel de nitrocelulosa con el objeto de determinar la presencia de anticuerpos específicos contra cada una de esas proteínas.

Esta técnica se realiza esquemáticamente en 3 pasos:

1. Se produce en cultivos celulares grandes cantidades de virus que luego son tratados químicamente para su disgregación e inactivación. Los antígenos resultantes del lisado viral se separan por electroforesis en gel de Poliacrilamida.

2. Se realiza una transferencia (blotting o electrotransferencia) de los Ag separados a membranas de nitrocelulosa.

3. Se coloca el suero del paciente sobre la membrana de nitrocelulosa. Posteriormente se añaden anticuerpos anti-inmunoglobulina humana unida a una enzima (peroxidasa o fosfatasa alcalina) y, por último, se agrega el substrato enzimático para la visualización de las bandas reactivas con un producto final coloreado.

La técnica es muy similar a un EIA, menos sensible pero más específica que esta.

En la práctica sólo el 3er paso es el que se realiza en los laboratorios de diagnóstico, ya que los equipos comerciales proveen de las tirillas con los antígenos. (Esto facilita la estandarización de las determinaciones).

Se trata de una técnica nueva que ha sido aplicada para el diagnóstico de la infección perinatal. Este procedimiento revela la presencia de anticuerpos antivirales producidos in vitro a partir de los linfocitos B extraídos de sangre total, lo que indicaría que el sistema inmune del paciente ha sido estimulado por el virus.

La producción de Ac antivirales in vitro promete ser de gran valor en el diagnóstico temprano de niños infectados por VIH.

1. Brock, D. Clínica y Diagnóstico Microbiológico. Biología de Microorganismos. Prentice Hall, 1988. New Jersey. 13: 488-489.

8. Zinsser (ed.). Diagnóstico Viral Rápido. Microbiología. 20ed. Editorial Médica Panamericana. 1994; 62: 1249-1260.

1. LAS SONDAS DE ÁCIDOS NUCLEICOS. http://www.ciencia-hoy.retina.ar/hoy20/sondas.htm