Curso de
Microbiología General
de Enrique Iáñez
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BIOSÍNTESIS Y CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR
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En el capítulo anterior estudiamos la composición
química, estructura y funciones de los principales tipos de paredes
celulares procarióticas. En este capítulo trataremos un aspecto dinámico
del tema de las paredes: cómo se sintetizan los principales tipos de
macromoléculas, cómo se ensamblan en la arquitectura global, y cómo
se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el
evento particular de formación del septo transversal que marca el
"nacimiento" de dos células hijas. Nos concentraremos en la
biosíntesis del peptidoglucano, debido a su interés intrínseco y
aplicado (sobre este proceso actúan diversos antibióticos, algunos de
gran importancia clínica).
- Desde el punto de vista topológico, todas las capas de las
envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son superficies
cerradas sobre sí mismas, físicamente continuas para mantener la
integridad y viabilidad de la célula.
- Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse
durante el crecimiento por incorporación de nuevos materiales. Además,
todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse
en los lugares precisos. Por ejemplo, en el caso de las bacterias
Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a parar a
diferentes localizaciones: periplasma, PG, membrana externa, e
incluso medio exterior.
- Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales
de las envueltas (y concretamente, de la pared celular que nos ocupa
ahora) deben de facilitar la división de la célula en una
descendencia de dos células hijas.
- Finalmente, queda el problema de la energía. Los procesos biosintéticos
requieren aporte de energía química, pero el ATP y compuestos
similares no pueden salir del protoplasto.
Precisamente en este capítulo vamos a ver algunas de las estrategias
bioquímicas y moleculares que las bacterias han evolucionado para
solventar estos puntos. El proceso en general es similar en
Gram-positivas y en Gram-negativas, pero existen diferencias debido a la
complejidad adicional representada por la membrana externa de
Gram-negativas.
Podemos clasificar las estrategias de biosíntesis de componentes de
la P.C. en tres grandes tipos:
- síntesis de la macromolécula en el citoplasma y transporte a
través de la membrana. Ejemplo: proteínas de la P.C.
- síntesis de precursores en el citoplasma + ensamblaje parcial en
membrana + transporte a la cara externa externa de la membrana +
ensamblaje final en el exterior, mediante reacciones que no precisan
energía. Ejemplos: síntesis de PG, de ácidos teicoicos, de
polisacáridos.
- síntesis de precursores en el citoplasma + ensamblaje completo en
la membrana citoplásmica + transporte al exterior. Ejemplo: síntesis
del LPS.
1 BIOSÍNTESIS DE PROTEÍNAS
DE PARED CELULAR | a Contenidos
Las proteínas de la P.C., tanto las estructurales como las enzimáticas
del espacio periplásmico, se sintetizan por polisomas asociados a la
cara interna de la membrana citoplásmica.
Las proteínas hidrofóbicas asociadas a la membrana externa
(y aquellas que deben exportarse al periplasma) se sintetizan como
pre-proteínas provistas en su extremo N-terminal de una secuencia líder
(también llamada péptido-señal), con una porción de carácter
hidrofóbico. Conforme el ribosoma va sintetizando la proteína, la
secuencia líder se ancla a la membrana, y facilita el paso del resto de
la proteína naciente al otro lado de la membrana. Esta proteína
naciente no puede en principio plegarse tridimensionalmente, debido a la
actuación de un complejo (complejo de reconocimiento de la señal).
Una vez que toda o casi toda la proteína ha pasado al otro lado de la
membrana, actúa una peptidasa del líder (localizada en el lado
exterior de la membrana) que rompe la secuencia-señal. Esto facilita a
su vez el que la proteína adquiera rápidamente su conformación madura
y que, en su caso, interaccione con otros componentes de la pared.
Aquellas proteínas que en su forma madura están modificadas químicamente
(por unión a azúcares, ácidos grasos o glicéridos) sufren estas
modificaciones a nivel de membrana citoplásmica.
La lipoproteína de Braun se sintetiza a partir de una pre-proteína
con péptido-líder, que se rompe a su paso por la membr. citopl.,
siendo modificado su extremo N-terminal a glicerol-tioéter. De esta
forma se puede insertar, por dicho extremo en la membrana externa. Como
ya dijimos, una tercera parte de la LPP de Braun se une covalentemente
al PG, en una reacción de transpeptidación: el enlace entre la D-ala
terminal(4) y el meso-DAP(3) del tetrapéptido del PG se sustituye por
el enlace entre dicho meso-DAP y el grupo amino de la lisina C-terminal
de la LPP.
Las porinas son una excepción al mecanismo de translocación de
proteínas descrito arriba: estas proteínas adquieren su configuración
definitiva a nivel de la membrana citoplásmica. Parece ser que alcanzan
la membrana externa a través de las denominadas zonas de adhesión o
junturas de Bayer.
2. BIOSÍNTESIS DEL
PEPTIDOGLUCANO DE MUREÍNA | a Contenidos
Consta de 4 etapas:
- Síntesis de precursores solubles en el citoplasma.
- Estos precursores son transferidos a un transportador lipídico
situado en la membrana citoplásmica (un poliisoprenol fosfatado
llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacarídicas
con el pentapéptido.
- Las unidades disacarídicas se polimerizan en cadenas lineales
fuera de la membrana, pero aún unidas al undecaprenil-fosfato de la
membrana.
- Unión del polímero lineal así formado al peptidoglucano
preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos)
parte de sus péptidos respectivos.
A estas etapas hay que añadir una fase adicional de regeneración
del transportador lipídico, una vez que ha cumplido su misión, para
que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de síntesis.
Veamos, pues, en más detalle, cómo ocurre este interesante proceso:
Fase 1: Desde glucosamina-1-P hasta UDP-NAM-pentapéptido, todo
el ciclo ocurre en el citoplasma, catalizado por enzimas
solubles. Se observará que los azúcares (tanto NAM como NAG) se
activan bajo la forma de nucleósido-difosfatos (concretamente, de uridín
difosfato, UDP). En general, los monosacáridos que han de incorporarse
a polímeros de pared celular bacteriana se activan mediante su unión
con nucleósidos-fosfato.
La NAG se activa por reacción del NAG-1-P con UTP, que libera
pirofosfato (PP) y produce NAG-UDP.
Observar cómo se produce la síntesis del NAM activado: el grupo
enol-pirúvico del fosfo-enol-pirúvico (PEP) se transfiere al -OH (3)
de la NAG, y enseguida ocurre una reducción enzimática (con NADPH2
como donador) que genera el 3-O-D-lactil-éter de la NAG, es decir, el
NAM (por supuesto, unido siempre al UDP).
Luego se va produciendo la adición secuencial y ordenada de los
distintos aminoácidos (en reacciones que requieren energía e iones Mn++).
Observar que no se produce un tetrapéptido, sino un pentapétido.
El último paso de adición de aminoácidos es la unión del dipéptido
D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:
- una racemasa convierte la L-ala a D-ala;
- creación de enlace peptídico entre dos D-ala.
Fase 2: El UDP-NAM-pentapéptido se transfiere ahora a un
transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato (que
abreviaremos como Lip-P).
El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 átomos de C (C55,
derivado de la repetición 11 veces de la unidad isoprenoide, con un
fosfato terminal). Antiguamente se le conocía con el nombre de bactoprenol,
pero esta denominación ha caído en desuso desde que se sabe que no es
exclusivo de bacterias. El bactoprenol permite el transporte y
ensamblaje de sustancias que, como los azúcares, son hidrofílicas, y
no podrían pasar por sí mismas la barrera hidrofóbica de la membrana.
Una vez que el NAM-pentapétido está unido al undecaprenil (por
medio de pirofosfato) se produce la unión con la NAG, en una reacción
de transglucosidación que genera el enlace ß(1 --> 4) entre
NAG-NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-P-MAM(pentapéptido)-NAG.
En esta situación es cuando se producen la
modificaciones que ya estudiamos en la estructura básica del PG. Por
ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutámico
en posición (2) es amidado (pasa a --CO-NH2. Por otro lado,
se introducen los puentes peptídicos, que en el caso de esta bacteria
consisten en una pentaglicina, que se une al grupo amino terminal de la
L-Lys en posición (3).
Fase 3: Polimerización de varias unidades disacarídicas: ello
se logra en una reacción de transglucosidación. Consiste en la
unión de cada unidad disacarídica (con su pentapéptido) unida a su
respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena
preexistente que a su vez está unida a otra molécula de Lip-P-P.
En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil,
pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P actúa una fosfatasa
específica, que elimina el fosfato terminal, regenerándose el
undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como el
descrito.
Fase 4: El polímero surgido de la fase anterior es una cadena
lineal de PG sin entrecruzar, y unido aún al transportador lipídico de
membrana. Ahora este polímero naciente (con sus pentapéptidos)
reacciona, por transpeptidación, con un PG aceptor preexistente.
En esta reacción se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del PG
naciente y el grupo -NH2 libre del diaminoácido (3) del PG
aceptor (o del último aminoácido del puente peptídico).
Esto es lo mismo que decir que el enlace peptídico
entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro
enlace peptídico, entre dicha D-ala (4) y el diaminoácido del PG
naciente.
La energía para esta reacción la suministra la hidrólisis
concomitante del enlace peptídico entre las dos D-ala terminales. Es
decir, en cada reacción de transpeptidación se libera una D-ala,
correspondiente a la que ocupaba la posición (5).
Ya dijimos en el capítulo anterior que no todos los tetrapéptidos
participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5) de los péptidos
no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima
llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima explica no sólo que en el PG
maduro existan tetrapéptidos (y no los pentapéptidos originales), sino
también la existencia de tripéptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su PG
maduro. Incluso algunas pueden eliminar totalmente muchos de los péptidos
originalmente unidos al NAM, mediante enzimas conocidas genéricamente
con el nombre de autolisinas. Así por ejemplo, Micrococcus
luteus -un coco Gram-positivo-, merced a su actividad
NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no está entrecruzado en un
50-70%.
Antibióticos que actúan a nivel de la biosíntesis de
peptidoglucano:
Estos antibióticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en
crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos del
ciclo de síntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulación de
precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la activación
de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y que
finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotónicos), por
entrada masiva de agua a la célula.
- Fosfomicina
: actúa inhibiendo la formación del 3-O-D-lactil-éter
de la NAG (o sea, del NAM). Parece ser que la base molecular estriba
en la semejanza estructural entre el este antibiótico y el PEP (es
decir, la fosfomicina es análogo estructural del PEP, lo que lleva a
la inactivación de la enzima correspondiente a esta reacción).
- Cicloserina
: Se comporta como análogo estructural de la
D-alanina, por lo que inhibe la actuación de la racemasa que
convierte la L-ala a D-ala, así como de la reacción de unión de dos
D-ala.
- Vancomicina y ristocetina
: inhiben la segunda transglucosidación
(fase 30), es decir, la unión
de diversas unidades disacarídicas.
- Bacitracina
: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su
desfosforilación, e impidiendo por lo tanto, la regeneración del
transportador de membrana.
- Antibióticos ß-lactámicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas)
:
inhiben la reacción de entrecruzamiento por transpeptidación. (Estudiaremos
su mecanismo
de acción en más detalle en el capítulo de Quimioterápicos
y Antibióticos).
3. BIOSÍNTESIS DE LOS ÁCIDOS
TEICOICOS | a Contenidos
Los ácidos glicerol- y ribitol-teicoicos se sintetizan según el
siguiente modelo:
Fase 1: En el citoplasma, activación de los polioles por unión
a nucleósidos difosfatos:
D-ribitol-1-P + CTP -------> CDP-ribitol + PP
Fase 2: Generación del esqueleto de poliol-P, a nivel de la
membrana citoplásmica, por sucesivas reacciones de unidades de
CDP-ribitol con lipoteicoico (LTC):
CDP-ribitol + LTC (ribitol-P)n ------->
LTC (ribitol-P)n+1 + CMP
Es decir, los LTC actúan simultáneamente como aceptores de
nuevas unidades de poliol-P y como transportadores de las cadenas
nacientes.
Los sustituyentes glucídicos y/o de D-ala se añaden ulteriormente a
los -OH del poliol, después de la polimerización.
Fase 3: Unión covalente de los teicoicos así sintetizados con
el PG naciente a través de la unidad de enlace,
interviniendo como transportador el undecaprenil-P .
4. BIOSÍNTESIS DEL
LIPOPOLISACÁRIDO | a Contenidos
El lípido A (junto con la parte proximal del núcleo) se sintetiza
en la membrana citoplásmica, por unión de ácidos grasos y KDO a la
unidad de glucosaminil-glucosamina.
El resto del LPS se sintetiza y se ensambla en la membrana citoplásmica,
por medio de dos procesos paralelos:
- Una ruta va produciendo las cadenas laterales repetitivas
polisacarídicas, que se encuentran unidas a una unidad de
undecaprenil-P.
- La otra ruta genera (por adición secuencial de los azúcares
pertinentes) el oligosacárido medular, usando como cebador y como
transportador de membrana al lípido A.
Ambas rutas acaecen en el lado interno (citoplásmico) de la membrana
citoplásmica. Una vez sintetizada la cadena lateral (unida a
undecaprenil-P) y el oligosacárido medular (unido al lípido A), pasan
a la cara externa (periplásmica) de la membrana citoplásmica, merced a
la translocación de los respectivos transportadores.
Finalmente, una enzima específica favorece la unión de la cadena
específica polisacarídica al oligosacárido medular-lípido A. Las
distintas moléculas de LPS se atraen entre sí, y pasan a la cara
externa de la membrana externa (su localización definitiva) merced a
las zonas de adhesión (junturas de Bayer) donde las dos membranas
coalescen.
Veamos en más detalle la síntesis del LPS:
4.1 Síntesis del Lípido A:
La glucosamina-1-P es convertida en
dihidroximiristil-glucosamina-1-P (por adición de dos restos de
hidroximirístico al N del C-2 y en el C-3, respectivamente).
Reacción con UDP-dihidroximiristil-glucosamina-1-P, para generar el
disacárido N-ß-hidroximiristil-glucosaminina-P.
Unión de arabinosamina al C-4' y de fosforil-etanolamina al C-1, lo
que da un lípido A aún sin esterificar.
Esterificación con ácidos grasos:
- láurico
- palmítico
- mirístico
De esta forma se obtiene el lípido A esterificado en todos sus
grupos hidroxilo originales.
4.2 Síntesis del oligosacárido medular:
Los azúcares se van añadiendo secuencialmente al lípido A. La
secuencia de adición viene fijada por el reconocimiento específico que
realizan las enzimas tanto de la molécula aceptora (lípido A-secuencia
"x" previa) como del donador nucleotidil-azúcar.
Se desconocen aún cuáles son los precursores nucleotídicos de las
heptosas.
Los precursores de las hexosas derivan del UTP, que genera la forma
activa UDP-hexosa.
4.3 Síntesis de las cadenas específicas laterales (antígeno O)
Cada unidad repetitiva se ensambla en forma de un intermediario
undecaprenil-P-unidad, a partir de los correspondientes
precursores nucleotídicos solubles de los azúcares (p. ej.,
UDP-galactosa, TDP-ramnosa, GDP-manosa, CDP-abecuosa).
Las unidades repetitivas se polimerizan entre sí, con liberación
de undecaprenil-pirofosfato:
Lip-P-P-{unidad} + Lip-P-P-{unidad}n
-----> Lip-P-P-{unidad}n+1 + Lip-P-P
- El polímero de la cadena lateral se transfiere, desde el Lip-P-P
que lo transportaba, hasta el extremo del oligosacárido medular
unido a su vez al lípido A:
Lip-P-P-{cad. lat} + LipA-oligosac ---->
LipA-oligosac-{cad. lat.} + Lip-P-P.
- Regeneración del undecaprenil-P por medio de la acción de la
fosfatasa específica del Lip-P-P.
5. CRECIMIENTO DE LA PARED
CELULAR | a Contenidos
Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la P.C. es una
estructura cerrada y sin solución de continuidad, debe permitir su
expansión (crecimiento), y esto supone que se han de romper ciertos
enlaces si se quiere que el nuevo material se ensamble con el
preexistente mediante nuevas uniones.
El crecimiento y septación del peptidoglucano están basados en la
actividad controlada y localizada en puntos determinados, de una batería
de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad
transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son los
sitios de acción de las penicilinas (y otros antibióticos ß-lactámicos),
se les conoce también con el nombre de PBP (de penicillin-binding
proteins; véase la tabla 6.1).
TABLA 6.1: Propiedades de las PBPs de Escherichia
coli
La división de la bacteria por fisión binaria simétrica se logra
por medio de una invaginación circular de las envueltas (membrana
citoplásmica y peptidoglucano) en mitad de la célula madre. En el
inicio de este proceso tiene un papel esencial la proteína FtsZ.
FtsZ es una proteína imprescindible, presente tanto en
eubacterias como en arqueobacterias, que muestra parecido con las
tubulinas eucarióticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ
se une a GTP, con lo que se promueve su polimerización. Bajo control
del ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la división en el
centro de la célula, formando un "anillo citocinético" en el
lado citoplásmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de
que la formación de este anillo de FtsZ señaliza el sitio por donde se
producirá la división y se activará el crecimiento del peptidoglucano
del tabique transversal.
La hipótesis señala que los polímeros de FtsZ se van
"contrayendo", de modo que "tiran" de las envueltas
hacia el interior, provocando la típica invaginación alrededor del
centro del bacilo, y que simultáneamente, la FtsZ provoca la activación
de la PBP3, que es una transglucosidasa/transpeptidasa específica
del tabique transversal.
A microscopio electrónico se observa que este tabique está formado
por dos láminas de PG (densas a los electrones) separadas entre sí por
otra transparente. El final de la división ocurre como consecuencia de
la invaginación de la membrana externa entre las dos láminas de PG.
¿Cómo se ensambla la membrana externa con relación al PG? Parece
ser que esta membrana se ensambla en buena medida por procesos espontáneos
guiados por interacciones entre el LPS y proteínas, sirviendo el PG
subyacente como andamio que facilita el montaje de toda la
estructura. Parece ser que las zonas de adhesión (junturas de Bayer)
son importantes para la correcta colocación de LPS y proteínas de la
membrana externa.
Recientemente se han descubierto zonas especiales donde la membrana
externa contacta con la citoplásmica. Se denominan anillos perisépticos,
debido a que rodean la superficie de la bacteria a ambos lados del septo
transversal Se desconoce aún su papel, pero parece que delimitan zonas
distintas de las envueltas de la bacteria, y algunos autores proponen
que participan en la segregación de los cromosomas.
Véase en la figura el experimento de marcado de P.C. con anticuerpos
fluorescentes, con ulterior seguimiento del marcaje al microscopio:
Véase igualmente la figura que muestra en más detalle la formación
del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que
posee una sola zona de crecimiento de PG, con dos regiones de deposición
de nuevo material: la región del tabique transversal propiamente dicho,
y la región adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la
expansión de la pared periférica, a ambos lados del tabique.
Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total
o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan protoplastos
las células bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared
celular, mientras que esferoplastos son aquellas células
bacterianas que poseen restos de pared.
Obtención. Existen dos posibles métodos alternativos:
En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la
forma normal eliminando el tratamiento (retirando la lisozima, o la
penicilina).
En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esféricas,
independientemente de la forma que tuviera la bacteria con pared de que
proceden.
Son células bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C.,
con formas pleomórficas, irregulares y globulares, que se producen de
forma espontánea en algunas especies bacterianas (p. ej., Streptobacillus
moniliformis) cuando se cultivan en medios a base de suero (que son
hipertónicos).
Las colonias de las formas L naturales son muy características: en
"huevo frito", bifásicas.
Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias
Gram-positivas y Gram-negativas, tratándolas con penicilina en medios
hipertónicos.
Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden
revertir con frecuencia a la forma normal con pared. Poseen algo de PG,
aunque éste se encuentra alterado respecto al PG de la célula normal.
Las formas L estables se producen por tratamientos más prolongados,
y no suelen revertir al tipo normal. La mayoría carecen totalmente de
PG.
Así pues, en las formas L el PG ha sido eliminado totalmente o
parcialmente, pero de manera que ya no pueden servir de aceptor de nuevo
PG.
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