Curso de Microbiología General
de Enrique Iáñez
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DIFERENCIACIONES DE
LA CÉLULA PROCARIÓTICA
ÍNDICE:
1. LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA ESPORULACIÓN
2. EXOSPORAS
3. DIFERENCIACIONES DE LOS ACTINOMICETOS Y OTROS ESTREPTIMICETOS
4. QUISTES BACTERIANOS
5. DIFERENCIACIONES DE LAS CIANOBACTERIAS
BIBLIOGRAFÍA
BARRA DE EXPLORACIÓN: Microbiología General
[ Principal ] [ Arriba ] [ Concepto e historia de la Microbiología ] [ Los microorganismos en el mundo vivo ] [ La célula procariota ] [ Curso de Microbiología General ] [ Biosíntesis y crecimiento de la pared celular ] [ Membrana citoplasmática y transporte de nutrientes ] [ Inclusiones citoplasmáticas ] [ Cuerpos nucleares. El genóforo bacteriano ] [ Expresión genética y exportación de proteínas ] [ Flagelos, fimbrias, prostecas ] [ Endosporas y otras diferenciaciones ] [ Crecimiento y division celular ] [ Crecimiento de poblaciones bacterianas ] [ Metabolismo energético bacteriano ] [ Desinfectantes y antisépticos ] [ Quimioterápicos y antibióticos ] [ Resistencia bacteriana a los antibióticos ] [ Regulación genética en las bacterias ] [ Mutación y supresión en bacterias ] [ Recombinación ] [ Transformación ] [ Transducción ] [ Conjugación bacteriana ] [ BIBLIOGRAFÍA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL ]
1. LA ENDOSPORA BACTERIANA Y LA
ESPORULACIÓN
1.1 INTRODUCCIÓN A
LA ESPORULACIÓN BACTERIANA
Algunas
especies de bacterias Gram positivas (principalmente de los géneros Bacillus,
Clostridium, Sporosarcina y Thermoactinomyces), disponen de una serie de
estrategias adaptativas cuando se ven sometidas a privación de nutrientes en su medio
ambiente:
- en principio, intentan alcanzar un medio ambiente más propicio,
- pero si finalmente la situación de hambre de nutrientes se mantiene, las células se
preparan para un largo período de carencia nutricional. En este caso se embarcan en un
proceso de diferenciación celular que conduce a la producción de una estructura especial
llamada endospora, que es una forma de reposo, durmiente (criptobiótica, es
decir de metabolismo prácticamente detenido), y que es capaz de resistir una amplia gama
de agentes agresivos ambientales, físicos y químicos.
En el primer caso antes citado, las respuestas consisten en lo
siguiente:
- En principio, cuando las células de Bacillus están creciendo activamente en un
medio rico en nutrientes, carecen de flagelos. Cuando los nutrientes comienzan a escasear,
se induce la síntesis de flagelos à las células se
mueven, en virtud de quimiotaxis positiva, hacia zonas donde detecten mayores
concentraciones de nutrientes.
- Si aun así, los nutrientes ricos vuelven a escasear, se inducen una serie de enzimas
intracelulares y extracelulares, destinadas a aprovechar nutrientes menos ricos:
- enzimas del ciclo de los ácidos tricarboxílicos, que permiten aprovechar el acetato
que previamente las células habían "desechado" como consecuencia de la
utilización de la glucosa.
- enzimas hidrolíticas extracelulares destinadas a degradar polímeros presentes en el
medio. Entre las enzimas excretadas encontramos proteasas, nucleasas, amilasas,
fosfatasas, etc.à los monómeros obtenidos son
transportados al citoplasma, donde son metabolizados o empleados en los procesos
biosíntéticos de mantenimiento.
- En el segundo caso (apartado 2 citado antes), si la bacteria sigue pasando hambre,
concretamente, si los niveles de fuentes de C, N, o P caen por debajo de un umbral, esto
constituye una señal a la célula de que se avecina un largo período de privación de
nutrientes. Entonces, la célula se implica en una serie de complejos cambios genéticos,
metabólicos, estructurales, etc. (proceso de esporulación), que conducen a la
diferenciación, en el interior de la célula vegetativa original, de una célula
durmiente (la endospora). La célula-madre (o sea, la célula vegetativa original
que generó la endospora) finalmente se autolisa, liberando la espora, que es capaz de
permanecer en estado criptobiótico, durmiente, varios decenios, -incluso siglos. Las
esporas son fácilmente diseminadas por el aire; cuando caen en medios ricos en
nutrientes, se desencadena su germinación, se reinicia la actividad metabólica,
de modo que cada espora genera una nueva célula vegetativa, capaz de divisón binaria,
etc.
O sea, la esporulación se puede considerar como un proceso de
supervivencia "en última instancia", la "última carta" que se juegan
ciertas bacterias Gram positivas cuando se enfrentan a condiciones severas de hambre de
nutrientes.
Significado adaptativo: Estas bacterias suelen vivir en medios
nutricionalmente pobres (suelos, hierba seca, etc.). La esporulación es un proceso muy
refinado que ha aparecido evolutivamente en una línea filogenética de bacterias
Gram-positivas, y que les permite sobrevivir largos períodos de carencia nutricional.
(¡Atención!: La endospora bacteriana NO es una forma de resistencia).
La esporulación bacteriana es un sistema modelo donde se pueden
estudiar, con relativa sencillez, determinados problemas biológicos más generales:
¿qué bases moleculares y genéticas tiene la diferenciación de un tipo de célula a
otro tipo distinto?, ¿cómo se regula el proceso en función del tiempo y del
espacio?, ¿cómo se "reparten los papeles" los tipos celulares
implicados?, etc. Por esta razón, presenta un enorme interés para los biólogos,
interesados en escudriñar las bases íntimas de este tipo de importantes cuestiones, tan
frecuentes en los organismos superiores.
Las endosporas son formas de reposo (y no formas reproductivas),
que representan una etapa del ciclo de vida de ciertas bacterias, y que se caracterizan
por una estructura peculiar, diferenciada respecto de las células vegetativas, por un
estado metabólico prácticamente detenido, y por una elevada resistencia a agentes
agresivos ambientales.
Al microscopio óptico, en fresco (sin teñir), aparecen como cuerpos
esféricos, ovoides e incluso en algunas especies, cilíndricos, muy refringentes,
libres, o aún incluidos en la célula vegetativa (célula madre).
Esporangio = célula madre + espora
El tamaño relativo de la espora, y su situación en el esporangio, son
criterios taxonómicos importantes en las bacterias esporulantes.
Según que el diámetro de la espora sea o no mayor que el de la
célula vegetativa:
- Esporas deformantes
- Esporas no deformantes
Según la localización de la espora dentro del esporangio:
- Terminal
- Subterminal
- Central
Los esporangios deformantes de Clostridium son característicos:
Tinción: No se tiñen por los colorantes normales. Hay que forzar
por calor y/o mordientes (por ejemplo, tras teñir reforzadamente con fuchsina, resisten
decoloración por alcohol-ClH). Otra tinción muy empleada es la reforzada con verde de
malaquita.
1.3 ESTRUCTURA
Y COMPOSICION QUIMICA DE LA ENDOSPORA
Partes que comprende la endospora:
- Protoplasto o núcleo
("core", en inglés), con la membrana citoplásmica de la espora (membrana
esporal interna).
- Pared de la
espora (= Germen de la pared de la futura célula vegetativa).
- Corteza o córtex,
rodeado externamente de la membrana esporal externa.
- Cubiertas.
- Exosporio (no
universal: las esporas de algunas especies carecen de él).
PROTOPLASTO O NÚCLEO
El citoplasma de la espora está muy deshidratado. Sus componentes
están inmovilizados en una matriz de quelatos de iones Ca++ y ácido
dipicolínico.
El citoplasma de la espora contiene altas concentraciones de ion Ca++
(1-3% del peso seco de la espora), y de ácido dipicolínico (DPA) (10% en peso); ambos
están formando un quelato, llamado dipicolinato cálcico (DPC), una sustancia exclusiva
de las esporas bacterianas.
Papel del DPC: Como veremos, es una "reserva de Ca2+",
que durante la esporulación secuestra este ión, lo que tendrá un papel importante en la
deshidratación del protoplasto; durante la germinación, la liberación del Ca++
será fundamental en este proceso.
El protoplasto contiene un cromosoma completo, condensado, y
todos los componentes indispensables para reiniciar el crecimiento vegetativo cuando la
espora germine, pero carece de muchos componentes típicos de la célula vegetativa:
- posee una pequeña
dotación de ribosomas, junto con componentes estables de la maquinaria de síntesis
de proteínas (ARNt, cofactores, etc.)
- ARN polimerasa.
- nucleósidos mono- y
difosfatados, pero no NTP (no hay ATP)
- carece de componentes
inestables: no hay ARNm, ni enzimas biosintéticas, ni aminoácidos ni bases
nitrogenadas libres, ni cofactores reducidos (NADH; CoA).
- pero en cambio, existe
una gran cantidad de una serie de pequeñas proteínas especiales (llamadas SASP,
del inglés "small acid-soluble proteins"). Cuando se produzca la germinación,
estas proteínas serán hidrolizadas rápidamente, y los aminoácidos resultantes serán
empleados en la síntesis de nuevas proteínas necesarias en la germinación y crecimiento
ulterior. Además, las SASPs están acomplejando al ADN (induciendo en él un cambio
conformacional hacia la rara forma A, en vez de la B habitual), protegiéndolo del daño
por luz UV.
Las diversas SASPs son muy parecidas en secuencia de aminoácidos.
Constituyen la primera familia multigénica que se ha descrito en procariotas. Cada
proteína está sintetizada por un gen monocistrónico (genes ssp). Los diversos
genes de la familia (que posiblemente han surgido por diversas duplicaciones génicas y
diversificación de secuencias) se encuentran dispersos por diversas regiones del
cromosoma de la bacteria.
Las proteínas SASPs tienen de 60 a 75 aminoácidos, y pueden llegar a
constituir el 5% de la proteína total de la espora. Cubren y acomplejan todo el nucloide
de la espora, a razón de un monómero de SASP por cada 5 pares de bases, protegiendo el
esqueleto del ADN, que pasa de configuración B a A.
- la "moneda
energética" de la espora es el 3-fosfoglicerato, otra molécula estable del
protoplasto, que será convertido rápidamente a 2-fosfoglicerato, y de él a PEP
(fosfo-enol-pirúvico) al germinar la espora (el PEP es donador de P para generar ATP).
Rodeando al protoplasto está la membrana citoplásmica (membrana
interna de la espora), una bicapa lipídica carente de fluidez, posiblemente
como resultado de su estructura policristalina.
PARED DE LA ESPORA (= GERMEN DE LA
PARED CELULAR DE LA CÉLULA VEGETATIVA)
Situación: inmediatamente por encima de la membrana interna de la
espora (ver micrografía a microscopio electrónico, o el esquema de la ultraestructura).
Composición: a base de un peptidoglucano (PG)
similar al de la célula vegetativa, con sus característicos enlaces entre los
tetrapétidos.
Funciones: al germinar la espora, dará lugar a la pared celular de
la nueva célula vegetativa, confiriéndole, mientras tanto, resistencia osmótica.
Origen: se sintetiza a partir de la prespora, atravesando los
precursores la membrana interior que hemos citado arriba.
CORTEZA O CÓRTEX
(Obsérvese su aspecto a microscopio electrónico: transparente a los
electrones, gruesa, a base de láminas concéntricas).
Composición: un peptidoglucano (PG) especial, diferente en
composición al PG de la célula vegetativa:
- 30% del NAM tiene
tetrapéptidos normales, pero el grado de entrecruzamiento es muy bajo (6%).
- 15% del NAM tiene solo
la L-ala inicial, en lugar de tetrapétido.
- 55% de una modificación
del ácido murámico (lactama del ácido murámico), producida por condensación del -COOH
lactilo con el -NH2, para formar la lactama correspondiente).
Origen: Se sintetiza a partir de la célula madre, con sus
intermediarios ensamblados a nivel de la membrana externa que rodea a la corteza.
Propiedades de la corteza:
- Tiene un bajo grado de puentes entre tetrapéptidos (sólo un 6%). Ello condiciona:
- una estructura más laxa, floja y flexible que el PG normal, capaz de expandirse en
ausencia de cationes que neutralicen sus grupos negativos (sobre todo del mDAP y del
glutámico de los tetrapéptidos). Esto es la base de su apariencia de gel.
- su rápida autolisis, durante la germinación de la espora.
- la lactama del murámico condiciona una gran resistencia a la lisozima.
La corteza está limitada por la membrana esporal externa,
procedente de invaginación de la membrana citoplásmica de la célula vegetativa madre.
Posee una polaridad opuesta a la de la membrana esporal interna.
CUBIERTAS
(Obsérvese, en las micrografías, su aspecto muy voluminoso: pueden
llegar a representar hasta 50% del volumen de la espora). Su aspecto es distinto
según las especies. Véanse las cubiertas de B. cereus (3 capas, dos granuladas,
en una matriz más transparente a los electrones), y de B. subtilis (capa interna
laminada, y capa externa muy densa a los electrones).
Composición: depende de las especies, pero en general, a base de
una o varias proteínas de tipo queratina, todas muy ricas en cisteína y en aminoácidos.
hidrófobos, y que llegan a constituir el 60% en peso seco de la espora. Buena parte de la
cisteína se añade post-traduccionalmente, por modificación de la proteína inmadura.
En B. cereus: un solo tipo de proteína, de 12 kD, muy rica en
cys, lo que supone abundancia de puentes disulfuro, y enlaces hidrófobos e iónicos.
En B. subtilis, 14 tipos de proteínas, igualmente ricas en cys
y aminoácidos. hidrófobos.
Propiedades: son muy insolubles e impermeables, e impiden la
entrada de numerosos agentes químicos, incluyendo sustancias tóxicas. La abundancia de
puentes S-S las hace muy compactas y muy estables químicamente.
EXOSPORIO
(No universal; ausente en esporas de ciertas especies).
En B. cereus es una estructura membranosa transparente, a modo
de saco cerrado, delgado y flojo, envolviendo al resto de la espora de una forma
"suelta", despegado en principio respecto de las cubiertas (tras la liberación
de la espora, al perderse el contenido acuoso que había entre exosporio y cubiertas,
aquel se pega a éstas).
En B. subtilis y B. megaterium, el exosporio está
envolviendo a la espora de una forma más estrecha, estableciendo algunos contactos
físicos con la superfie de las cubiertas.
Composición química: mezcla de proteínas, polisacáridos
complejos, y lípidos.
Estructura: Capa interna, de 16 nm de grosor, formada por el
ensamblaje de subunidades de simetría hexagonal, que dejan unas perforaciones de 7,6 nm
de diámetro. Capa externa, de 6 nm de grosor, de la que salen hacia el exterior unas
protuberancias a modo de pelos, de unos 25 nm de longitud.
Propiedades: muy resistente a enzimas proteolíticas, lo que
sugiere (pero no prueba directamente) que el exosporio puede representar algún papel como
barrera de defensa externa de la espora. También se ha sugerido (pero no comprobado) que
pudieran actuar concentrando las proteínas que constituyen las cubiertas.
Para que se produzca la esporulación, se necesitan dos condiciones
previas:
- los cultivos bacterianos han de estar en buenas condiciones;
- cuando cesa el crecimiento exponencial, la mayoría de las células entran en
esporulación, aunque el proceso no es sincrónico (hay desfases entre unas células y
otras), de modo que en un lapso de tiempo relativamente breve (5,5-8 horas en Bacillus
subtilis) casi todo el cultivo aparece en forma de esporas, habiendo desaparecido las
células vegetativas. La división celular típica de la fase de crecimiento
exponencial y la esporulación son procesos mutuamente excluyentes.
¿Qué estímulo es el responsable de desencadenar la
esporulación? En principio, se pueden plantear dos hipótesis distintas:
- la esporulación se debería a la acumulación de sustancias tóxicas o productos de
desecho en el medio de cultivo;
- la esporulación se debería a la carencia de algún tipo de nutriente.
Veamos cómo se demuestra que la hipótesis a) es falsa:
Realicemos un sencillo experimento que apoya la hipótesis b):
Tomemos un cultivo que aún esté en mitad de la fase exponencial; lo
lavamos y lo transferimos a agua destilada o a un medio pobre en nutrientes. Comprobamos
que al cabo de poco tiempo se induce la esporulación. Este fenómeno se puede calificar
de esporulación endotrófica, es decir, estamos comprobando que la bacteria
desencadena la esporulación porque debe de estar agotando algún nutriente interno (en el
agua destilada no hay nutrientes, como es lógico, ni hay productos de desecho ni
sustancias extrañas).
Es decir, lo que detiene el crecimiento de estas bacterias y dispara
la esporulación es un estado de inanición, de carencia de nutrientes. Si en el
experimento anterior añadimos el nutriente limitante al medio o al agua destilada antes
de que la bacteria alcance la fase estacionaria, se puede evitar que el cultivo entre en
esporulación (hasta que se agote el nutriente que se haga limitante).
El nutriente limitante que puede desencadenar la esporulación
puede ser: la fuente de carbono, la fuente de nitrógeno o incluso la carencia de
fosfatos.
¿Qué ocurre a nivel intracelular para que se desencadene la
esporulación? Esta es una de las facetas más oscuras aún. Se han venido manejando
varias hipótesis:
- Hipótesis del "gatillo disparador" único: Propugna la existencia de algún
factor de la célula vegetativa que induce la esporulación al llegar el cultivo a un
determinado estado, o bien la existencia de un factor vegetativo que está bloqueando la
esporulación, pero que se inactiva cuando el cultivo llega a ese estado.
Por ejemplo, se maneja la posibilidad de que se vaya
produciendo durante el crecimiento vegetativo un nucleótido especial tetrafosforilado
(ppGpp) que provocara una disminución de los niveles de NTP y NDP, lo que a su vez
induciría los genes de la esporulación que hasta ese momento se habían mantenido
silenciosos.
- Hipótesis de los pasos múltiples acumulativos: Conforme la bacteria va cambiando de
sustratos (conforme va agotando unos y recurriendo a otros) va acumulando una serie de
cambios metabólicos internos, hasta que se llega a un determinado "umbral" o
cambio clave, desencadenante.
- Hipótesis "mixta" con elementos de las dos anteriores: El desencadenamiento
sería resultado de una serie de cambios interconectados del metabolismo biosintético,
pero además, en algún momento, entraría en juego algún evento regulatorio concreto.
Existiría un "punto de no retorno" en el que el proceso se hace irreversible.
Ese punto de irreversibilidad consiste, quizás, en la irreversibilidad acumulada de una
serie de procesos individuales.
De hecho, hoy se sabe que Bacillus subtilis entra en esporulación una vez que
ha integrado una amplia variedad de señales ambientales y fisiológicas, que conducen
finalmente a la activación de la proteína Spo0A, que es un regulador transcripcional
esencial en el desencadenamiento de esta esporulación.
Estas señales son encauzadas a un sistema de repetidores basados en fosforilaciones
sucesivas, hasta que llegan a la Spo0A, que queda convertida en la forma activa Spo0A-P.
La ruta de repetidores es más o menos así:
- Hay al menos 3 histidín-proteínquinasas que donan su fosfato a la Spo0F.
- De Spo0F el P pasa a la Spo0B
- De la Spo0B el P pasa a la Spo0A.
Además, la Spo0A-P está sometida a la modulación de fosfatasas específicas, como la
Spo0E.
Una vez fosforilada, la Spo0A-P pone en marcha una serie de circuitos reguladores
positivos y negativos, y entre otros, activa la transcripción de al menos 7 genes que
determinan la entrada en esporulación. (Ello lo hace interaccionando con los
correspondientes promotores y con formas de ARN con subunidades s
especiales).
1.5 FASES DE
LA ESPORULACIÓN
Vamos a estudiar la esporulación en Bacillus subtilis o en B.
megaterium, dos de las bacterias esporuladas mejor investigadas, y que completan la
esporulación al cabo de unas 7-8 horas de su inicio, a 370C. Se pueden
distinguir siete fases consecutivas (además de la fase "0" anterior a la
esporulación). Cada fase se denota con un número romano, y su duración en horas se
expresa como subíndice de t, p. ej., t2. Como veremos enseguida, cada
fase se distingue por un(os) evento(s) citológico(s) peculiar(es) y por una serie de
cambios bioquímicos propios:
Fase 0 (célula vegetativa):
Al final del periodo de crecimiento exponencial, la célula vegetativa
contiene dos cromosomas.
Fase I (t0-t1):
- El material genético
(los dos cromosomas) se condensa constituyendo un filamento axial ancho, que ocupa
el centro de la célula, según su eje longitudinal. Cada nucleoide está unido a uno de
los extremos de la célula.
- En vez de iniciarse una
división celular simétrica (con septo central), se forman dos espículas de la pared
celular cerca de los polos hacia el interior, rodeadas de la correspondiente
invaginación de la membrana citoplásmica. Cada espícula está señalando una zona donde
se está formando el anillo de FtsZ (proteína contráctil de tipo tubulina: véase el tema 6)
- Se sintetizan y se
liberan al medio antibióticos y varias exoenzimas. Una serie de proteasas
se encargan del turnover de proteínas intracelulares, cuyos aminoácidos constituyentes
serán empleados para sintetizar nuevas proteínas específicas de la esporulación.
Fase II (t1-t2):
Se termina por formar un septo transversal acéntrico, cerca de
un polo de la célula, por invaginación de la membrana citoplásmica, y deposición de
nuevo PG entre las dos membranas adyacentes.
Cada nucleoide queda segregado en uno de los dos compartimentos que
se han formado:
- un cromosoma va al compartimento pequeño (compartimento de la preespora);
- la otra copia del cromosoma va al compartimento grande (célula madre).
La segregación del cromosoma que queda en el compartimento de la
preespora es muy interesante: Conforme el septo acéntrico se va cerrando, la mayor parte
del cromosoma (un 70%) queda "fuera" de lo que será el límite entre preespora
y célula madre: es decir, por sí mismo, sólo un 30% de ese cromosoma quedaría en la
preespora. Pero la proteína SpoIIIE actúa como una translocasa de ese cromosoma, y lo
"empuja" al interior del compartimento de la preespora antes de que éste se
cierre. Parece ser que el mecanismo guarda cierto parecido con el de transferencia de
ciertos plásmidos conjugativos de Streptomyces.
En esta fase continúa la síntesis de los antibióticos y de las
exoenzimas (serina-proteasas, metalo-proteasas, ribonucleasas, a-amilasa,
etc).
Fase III (t2-t3):
- Independización del
protoplasto de la preespora respecto de la célula madre. Para ello, lo primero que
ocurre es la degradación selectiva del PG del septo que se había depositado en la fase
II (esta degradación comienza por el centro, es decir, por donde se había cerrrado, y
sigue hacia la periferia, y en ella intervienen los productos de varios genes). Entonces,
la membrana citoplásmica de la célula madre va creciendo unidireccionalmente alrededor
de la preespora, hasta que ésta queda libre en el citoplasma del esporangio.
Obsérvese que el citoplasma de la preespora queda rodeado por dos
membranas de polaridad opuesta: la interior tiene la polaridad normal, pero la
exterior, derivada del crecimiento de la membrana de la célula madre, tiene polaridad
invertida
- A partir de esta fase el
turnover (renovación) de proteínas sólo tendrá lugar en la célula madre,
deteniéndose en el compartimento de la preespora.
Fase IV (t3-t4):
- Se forma casi por
completo la corteza de la espora, por deposición de peptidoglucano entre las dos
membranas. Sin embargo este PG aún no está "maduro" (no tiene todavía las
características que estudiamos en el apartado 1.3.3).
- También se deposita el
peptidoglucano de la pared celular (que constituye el germen de la pared celular de
la futura célula vegetativa).
- Coincidiendo con esto,
la preespora adquiere su aspecto refráctil al microscopio óptico en fresco.
- Comienza la síntesis
del ácido dipicolínico (DPA), así como la acumulación de Ca2+.
- En las bacterias que lo
poseen, en esta fase comienza la síntesis del exosporio.
Fase V (t4-t5,5):
- Los materiales de las cubiertas
(que se habían ido sintetizando durante las fases II y III en el compartimento de la
célula madre), comienzan a depositarse por fuera de la membrana esporal externa.
Las cubiertas de B. subtilis están formadas por unos 14 tipos
de proteínas, que se van ensamblando por etapas sucesivas, dando diversas capas, cada una
con una composición de polipéptidos característica. La incorporación postraduccional
de grandes cantidades de cisteína completará la estructura. El proceso no consiste en
una deposición ordenada de capas desde el interior al exterior, sino más bien una
construcción con andamiaje:
- La proteína SpoIVA (que
no es una proteína de la cubierta, propiamente dicha), se dispone sobre la membrana
esporal externa, y recluta proteínas de andamiaje desconocidas.
- Entonces se ensambla la
proteína CotE en la parte externa de este andamio, y a su vez va a reclutar otras
proteínas mayoritarias: proteína de cubierta interna (CotD), que dará la estructura que
se ve laminar a microscopio electrónico, y proteína de cubierta externa (CotA) que
interviene en las capas externas densas a los electrones.
- Luego se van
incorporando las demás proteínas de las cubiertas.
- Al final de esta fase se
adquiere la resistencia al octanol.
- Continúa la
acumulación de DPA, que sigue secuestrando iones Ca++ (formación del quelato
de dipicolinato cálcico, DPC).
La célula madre sintetiza el DPA, que es transportado a la preespora.
El Ca2+ es captado por transporte activo por el esporangio, pero pasa por
difusión facilitada desde la célula madre a la preespora, donde rápidamente es quelado
por el DPA, lo que a su vez es un estímulo para la entrada de más Ca++. Esta
difusión facilitada es consecuencia de que la polaridad de la membrana esporal externa
está invertida: el Ca++ no puede pasar por transporte activo.
Fase VI (t5,5-t7):
- La preespora madura
hasta espora.
- Madura la corteza (para
generar el característico PG cortical, más laxo, con su bajo porcentaje de
entrecruzamientos -por actuación de endopeptidasas- y la lactama del NAM).
- Maduran las cubiertas.
- El citoplasma de la
espora se hace más homogéneo y más denso a los electrones.
- Por una serie de razones
aún no totalmente aclaradas, la espora se hace resistente al calor y al cloroformo.
- Se adquiere resistencia
a las radiaciones ultravioleta (UV).
- Se adquiere resistencia
a la lisozima.
Fase VII (t7-t8):
- Liberación de la
espora madura por autolisis de la célula madre.
- En las bacterias que han
producido exosporio, cuando la espora sale al exterior, este exosporio pierde su contenido
de citoplasma (procedente de la célula madre), quedando como un saco vacío y plegado,
unido a las cubiertas.
1.6 GENÉTICA
MOLECULAR DE LA ESPORULACIÓN
Las células pueden detener el proceso de la esporulación si durante
las 4 primeras fases se les suministra el nutriente que estaba limitando y que fue
responsable del desencadenamiento (efecto de desbloqueo metabólico). Pero a partir
de la fase V el aporte de nutrientes no tiene ya ese efecto inhibidor: el proceso de la
esporulación ya es irreversible, y se dice que la célula está comprometida (=
obligada) a esporular.
El proceso de la esporulación es muy ordenado en el tiempo y en el
espacio. En su base genética existe un conjunto de varios operones específicos de la
esporulación (operones spo), sometidos a un finísimo control genético
espacial y temporal. El conjunto de estos operones (que se encuentran en cuatro zonas
distintas del cromosoma), se denomina esporulón, y comprende más de 125 genes.
Las principales características de los operones del esporulón son:
- Los operones están
inactivos durante el crecimiento vegetativo;
- se van activando de
modo ordenado y secuencial, para luego ser reprimidos (una vez han actuado);
- están sometidos a
interacciones pleiotrópicas unidireccionales;
- existe una
"comunicación" regulatoria entre el compartimento de la espora y de la célula
madre (interacciones espaciales);
- dentro de los mecanismos
genéticos implicados en la expresión y regulación de los distintos operones
correspondientes a fases distintas de la esporulación, un papel muy importante es el
jugado por las subunidades sigma (s ) alternativas de la
ARN-polimerasa.
Como se recordará, la holoenzima de la ARN-polimerasa
reconoce el promotor merced a la subunidad s . En la célula vegetativa existe un tipo
"estándar" de esta subunidad, capaz de reconocer los promotores de genes
vegetativos. Pues bien, durante la esporulación asistimos a una sustitución de
subunidades s en distintas fases del proceso. Cada subunidad desplaza a la que actuó
en la fase anterior, de modo que en la fase actual la ARN polimerasa reconoce nuevos tipos
de promotores, y transcribe los genes específicos de esa fase. Aún más, existen
subunidades s diferentes en la célula madre y en la preespora.
Si queremos resumir la regulación genética de la esporulación desde
el punto de vista de las distintas subunidades s y del "diálogo" entre la
prespora y la célula madre, podríamos tener el siguiente cuadro (adaptado de
Stragier & Losick, 1996):
Al final del crecimiento exponencial, y durante la fase estacionaria,
una serie de cambios fisiológicos y ambientales son detectados y esa información es
canalizada hacia el "repetidor de fosfatos", lo que lleva a que se acumule
Spo0A-P.
Esta Spo0A-P induce (junto con las holoenzimas provistas de sA
y sH) la expresión de una serie de genes y operones, lo que permite la entrada
en esporulación. Uno de los primeros indicios de esto es la formación de un septo
acéntrico (polar).
La formación del septo polar está implicada en activación de una
nueva subunidad s, la llamada sF, que actúa desde la preespora.
La sF de la prespora induce a su vez la aparición de la sE
en la célula madre.
A su vez, la sE, junto con el englobamiento de la prespora
por la célula madre, ocasiona la aparición de sG en la prespora.
Finalmente, sG pone en marcha una cadena de acontecimientos
que conducen a la aparición de sK en la célula madre.
Al mismo tiempo, los dos compartimentos siguen rutas paralelas de
control de transcripción:
- En la prespora, sF
dirige la transcripción de sG, que a su vez dirige la transcripción del gen
de la proteína de unión a ADN, SpoVT.
- De igual manera, en la
célula madre, la sE conecta el gen de otra proteína de unión a ADN, la
SpoIIID, que a su vez logra la transcripción y construcción del gen de la sK,
que a su vez activa el gen de factor transcripcional final, GerE.
1.7 CUERPOS PARASPORALES
Algunas bacterias esporuladas, como Bacillus thuringiensis, B.
popiliae y algunas especies de Clostridium, forman cristales proteicos en el
esporangio simultáneamente a la formación de la endospora: son los llamados cuerpos
parasporales.
Cada célula madre exhibe una sola inclusión, que se puede presentar
libre en el citoplasma, o bien englobada en el exosporio de la espora. Los cuerpos
parasporales pueden ser amorfos, pero los más típicos son pseudocristales
octaédricos (bipiramidales). Están compuestos de la agregación regular de
subunidades de una glucoproteína de unos 120 kDa, sintetizada durante la fase IV.
La función de estos cuerpos parasporales en la esporulación es
desconocida (e incluso puede que de hecho, no tenga tal tipo de función). Bajo
condiciones alcalinas, se disuelven y la proteína se convierte en una poderosa toxina
para larvas de lepidópteros y otros insectos, cuando las ingieren vía oral
(pero no por vía parenteral). Veamos cómo se produce el proceso de la toxicidad:
- La oruga come materia vegetal que lleva bacterias esporuladas. El cuerpo parasporal se
libera junto con la espora, cuando la célula madre se autolisa.
- Los cuerpos parasporales se disuelven en el tracto digestivo de la oruga (que es
alcalino), la proteína sufre proteolisis, lo que la transforma en una toxina.
- Esta toxina altera la permeabilidad del epitelio intestinal de la oruga, de modo
que los líquidos alcalinos del intestino pasan a la hemolinfa, que incrementa su
pH por encima de 8, lo cual termina provocando la parálisis rápida del insecto.
El significado biológico más probable de este fenómeno es que la
producción de cuerpos parasporales sea una variante de la esporulación que evolucionó
durante la adaptación de estas bacterias a sus nichos ecológicos, como una manera de
asegurar la germinación de las endosporas: la oruga ingiere los cristales junto con
las esporas. Los cristales parasporales matan a la oruga, que se pudre. La oruga muerta y
en putrefacción aseguraría un entorno adecuado en nutrientes para que se alimentaran y
multiplicaran las células vegetativas que surgieran de la germinación de esas esporas.
Desde hace tiempo ciertos grupos de agricultores vienen usando
inóculos de bacterias esporuladas de las especies productoras de cuerpos parasporales
para rociar sus plantas y protegerlas de insectos: estamos ante un auténtico insecticida
biológico, biodegradable, selectivo hacia las plagas e inofensivo para los seres
superiores.
La moderna Ingeniería Genética ha logrado insertar y expresar genes
codificadores de las toxinas parasporales de Bacillus thuringiensis en plantas de
cultivo. Hoy día existen millones de hectáreas de cultivo de plantas transgénicas
(sobre todo algodón, maíz y patata) que dependen menos de los insecticidas químicos
merced a estos genes bacterianos (aunque ello no ha evitado las críticas de ciertos
grupos ecologistas opuestos por sistema a todo lo que suene a manipulación genética por
técnicas de ADN recombinante).
(En otras partes de este sitio web se habla de estos aspectos
biotecnológicos y sus polémicas)
1.8 PROPIEDADES
BIOLÓGICAS DE LAS ESPORAS: SU FUNDAMENTO
Las endosporas son células en estado de dormancia, con una bajísima
tasa metabólica (hipometabolia, la menor que existe en el mundo vivo), y capaces de
conservar su vitalidad durante larguísimos períodos. Son muy resistentes a la
acción de diversos agentes químicos (octanol, cloroformo) y físicos (altas
temperaturas, congelación, desecación, radiaciones).
- Hipometabolia:
Poseen la más baja tasa respiratoria de todos los seres vivos. Por
ello son capaces de sobrevivir en ausencia de nutrientes durante largos períodos de
tiempo.
- Dormancia:
Esta propiedad se refiere al hecho de que la espora tiene una gran
inercia a los sustratos exógenos. Como veremos, la espora sólo perderá la dormancia
cuando se haya activado para la germinación.
- Resistencia al calor:
Las esporas de ciertas especies resisten 120oC
durante 15 min, lo cual condiciona los parámetros para esterilizar materiales (véase
el capítulo 17 titulado "Acción de agentes físicos sobre las bacterias").
Esta elevada resistencia a las altas temperaturas es un subproducto de los cambios
evolutivos que condujeron a la deshidratación como medio para lograr la hipometabolia y
la dormancia.
- Deshidratación:
El muy bajo contenido en agua de la espora (0.3 g de agua/g de peso
seco frente a los 3-4 g de agua/g de peso seco de la célula vegetativa) hace que la
espora sea muy refráctil al microscopio óptico en fresco. Ello condiciona las
propiedades 1, 2 y 3. ¿Cuál es el mecanismo de la deshidratación, base a su vez de
tantas propiedades biológicas de las endosporas? El tema es aún objeto de debate. Vamos
a exponer brevemente una hipótesis (1989), según la cual habría 3 etapas en la
consecución de la espora deshidratada y resistente al calor:
- Desmineralización osmótica inicial.
Durante la fase III de la esporulación se
produce una acidificación del espacio cortical que conduce a la acidificación del
protoplasto de la prespora. Para equilibrar la entrada de H+, del protoplasto
sale gran cantidad de iones K+, junto con moléculas de agua.
- Remineralización con Ca++ (fases IV-V).
El ácido dipicolínico va
entrando al protoplasto de la prespora. Simultáneamente el Ca++ entra a la
célula madre por transporte activo, y de ella al protoplasto de la prespora por difusión
facilitada. Se forma el correspondiente quelato de dipicolinato cálcico (DPC). Como
vimos, este es un proceso con retroalimentación positiva, ya que conforme el Ca++
queda "secuestrado" en forma de quelato (lo que significa que no hay de hecho
iones Ca++ libres en el interior de la prespora), se facilita más la entrada
de mayores cantidades de Ca++. Parte del Ca++ y de otros cationes se
acomplejan también con macromoléculas del protoplasto. Todo ello redunda en que la
corteza se queda sin cationes; por lo tanto, no hay posibilidad de neutralizar las
cargas negativas del PG cortical à las cargas negativas se
repelen à se produce la expansión del PG cortical à en su expansión, la corteza se "topa" con las
cubiertas rígidas, por lo que presiona sobre el protoplasto à
sale más agua del protoplasto.
- Resultado final: termoestabilización (= termorresistencia) del protoplasto.
La gran
pérdida de agua hace que los diversos compuestos del protoplasto se compacten entre sí,
lo que facilita sus interacciones con los cationes. El resultado es la formación de un
gel a base de una matriz constituida por complejos supramoleculares, macromoléculas y
pequeñas moléculas densamente empaquetados, unidos entre sí e inmovilizados.
Parece ser que esta es la base principal de la enorme resistencia a las altas temperaturas
de la endospora.
- Resistencia a los rayos UV:
Parece que depende de varios componentes:
- absorción de luz UV por las cubiertas;
- por el DPC;
- pero cada vez está más claro que las proteínas SASPs tienen un papel central
en esta resistencia a los UV. Como ya dijimos, las SAPS acomplejan al ADN. Se ha
comprobado que evitan la depurinización de ese ADN, y provoca un cambio en su
fotoquímica (ver apartado siguiente);
- cambio en la fotoquímica del ADN de la espora
: se puede explicar parcialmente por
la misma deshidratación del protoplasto, que impide que se formen dímeros de
pirimidina entre pirimidinas adyacentes de una misma cadena del ADN. Como veremos en el
capítulo 18, estos dímeros de pirimidina constituyen el principal tipo de fotoproductos
generados por rayos UV en el ADN de la célula vegetativa, base de la mayor parte de los
efectos deletéreos de estas radiaciones. Sin embargo, en la espora la luz UV genera otro
tipo de alteración, llamada fotoproducto de la espora (que consiste en
5-timinil-5,6,dihidrotimina) que se produce en menor cantidad. Recientemente está
quedando cada vez más claro que el principal responsable de ese cambio en la fotoquímica
son las proteínas SASPs: al acomplejar al ADN, esas proteínas provocan un
descenso marcado de la susceptibilidad a la formación de dímeros de pirimidina y el que
aparezca el fotoproducto de la espora. La acumulación de fotoproductos de la espora puede
ser igualmente letal, pero cuando germina la espora se pone inmediatamente en marcha un
eficiente sistema de reparación específico de ese fotoproducto.
- Resistencia a agentes químicos:
La resistencia de la endospora a agentes como
octanol, cloroformo, etc. se debe a la impermeabilidad de las cubiertas, gracias a
su gran grosor y su peculiar composición a base de proteínas ricas en aminoácidos
hidrófobos y con abundantes puentes disulfuro (cistinas).
La germinación es el proceso por el cual una espora se convierte al estado vegetativo.
Es mucho más rápida que la esporulación (dura unos 90 minutos). Podemos considerar en
ella cuatro etapas, según el modelo de Foster y Johnstone (1990)
- preactivación
- activación
- iniciación (o germinación en sentido estricto)
- crecimiento ulterior (entrada en fase vegetativa)
PREACTIVACIÓN
Antes de que la espora esté en condiciones de germinar se requiere que
sus cubiertas se alteren. En la naturaleza esto ocurre por erosión por envejecimiento
progresivo. Artificialmente, en laboratorio, se puede recurrir a algún procedimiento para
alterar esas cubiertas:
- tratando las esporas a
altas temperaturas, pero inferiores a su inactivación (100oC durante unos minutos);
- por radiaciones
ionizantes;
- por pH bajos;
- por tratamiento con
sustancias que posean grupos -SH libres (p. ej., mercaptoetanol).
ACTIVACIÓN
La activación es una etapa aún reversible, desencadenada por un
agente químico externo (germinante) presente en el medio. Este agente es variable según
las especies:
- iones inorgánicos (Mn++,
Mg++);
- L-alanina en B.
subtilis;
- glucosa u otros
azúcares;
- adenina u otras bases
nitrogenadas.
El germinante es detectado por un receptor alostérico a nivel de la
membrana esporal interna. Una vez que dicho receptor se activa, adquiere una capacidad
proteolítica específica que le permite romper una proenzima que hasta ese momento se
encontraba unida covalentemente al PG de la corteza. La enzima resultante reconoce la
lactama del NAM y comienza a hidrolizar el PG cortical. La consecuencia es que comienza a
entrar agua al protoplasto de la espora, por lo que la espora pierde su característica
refringencia, y se comienza a perder la resistencia al calor.
Durante toda esta etapa el metabolismo está aún latente.
INICIACIÓN O GERMINACIÓN EN
SENTIDO ESTRICTO
En esta etapa la germinación se hace ya irreversible, y se rompe
definitivamente el estado de dormancia, si bien el metabolismo es endógeno (no depende
todavía de sustancias externas). Los principales acontecimientos bioquímicos son:
- se pierde DPA, lo que
supone pérdida de Ca2+
- este Ca2+
pasa al córtex, donde neutraliza las cargas negativas --> se favorece la
rehidratación del protoplasto y su hinchamiento, favorecido por la concomitante
contracción del córtex, mientras continúa y se completa rápidamente la hidrólisis del
PG cortical;
- el 3-fosfoglicérico
(3-PG) se convierte en 2-PG, y éste en PEP, que a su vez dona su fosfato de alta energía
para producir ATP;
- las pequeñas proteínas
SASPs se hidrolizan por una proteasa específica (llamada GRP) que hasta ese momento
estaba inactiva. De este modo los aminoácidos constituyentes de las SASPs se reutilizan
para la síntesis de nuevas proteínas por parte de la pequeña dotación de ribosomas y
demás moléculas accesorias;
- La ARN polimerasa
comienza a sintetizar ARN (comienza la transcripción de genes vegetativos).
TERMINACIÓN Y CRECIMIENTO
ULTERIOR
Aparece ya el metabolismo exógeno, de modo que la espora puede tomar
nutrientes del exterior y metabolizarlos. Los eventos bioquímicos y estructurales más
notorios son:
- se sintetiza ADN;
- el protoplasto crece
aún más;
- la pared de la espora
sirve como cebador (germen) para la producción de la pared de la célula vegetativa
naciente;
- la célula vegetativa
sale por rotura de las cubiertas, que puede ser de tipo polar o ecuatorial. Hay que
aclarar que al salir, esta célula vegetativa se tiñe como Gram-negativa, y sólo
adquirirá su típica grampositividad después de la primera división.
Determinadas bacterias (Methylosinum, Rhodomicrobium) forman
esporas reproductivas por gemaciones sucesivas al final de sus prostecas.
Estas exosporas poseen una envuelta a base de pared rodeada de una cápsula o cubierta
gruesa.
3. DIFERENCIACIONES EN LOS
ESTREPTOMICETOS Y OTROS ACTINOMICETOS
Los actinomicetos constituyen un grupo amplio y complejo de bacterias
Gram positivas con tendencia a un tipo de crecimiento micelial y un estilo de vida
similar a los hongos (de ahí el nombre de Thallobacteria para esta clase). Muchos
de los taxones de Actinomicetos y bacterias relacionadas poseen células diferenciadas de
tipo reproductivo, genéricamente conocidas como esporas. Estudiaremos brevemente la
diferenciación en dos géneros típicos.
Género Actinoplanes
Las especies de este género producen micelios vegetativos de
sustrato (subterráneos). Algunos de estos micelios generan hifas verticales que
sobresalen a la superficie. El extremo de cada una de estas hifas se diferencia para
constituir un saco llamado esporangio, que se fragmenta en un conjunto de esporas
móviles (flageladas) llamadas zigosporas o esporangiosporas.
Género Streptomyces
Forma un micelio de sustrato ramificado, interrumpido de vez en
cuando por pared transversal (son por lo tanto organismos cenocíticos, es decir, el
segmento de micelio limitado por dos tabiques sucesivos contienen varios cuerpos
nucleares). Cuando hay limitación de nutrientes se comienza a formar un micelio aéreo
a partir de ramificaciones de las hifas subterráneas. En los extremos de algunas de estas
hifas aéreas las células se diferencian en cadenas de esporas. Durante la
formación de estos micelios aéreos y de las esporas la población de micelios
subterráneos sufre una lisis masiva.
Propiedades de las esporas de los estreptomicetos:
- la pared celular de la
espora es más gruesa que la de la célula vegetativa;
- no hay cambio
cualitativo en el PG;
- no hay córtex ni
cubiertas;
- son muy hidrofóbicas:
se resisten a ser suspendidas en agua. Esto parece que se debe a una vaina que
rodea a la P.C., compuesta a base de túbulos auto-ensamblables.
- resisten más al calor y
a la desecación en comparación a las células vegetativas, pero menos que las
endosporas.
- son metabólicamente
durmientes (células en reposo).
Son células que se producen en algunas especies por engrosamiento
de la P.C. de la célula vegetativa, por deposición de nuevos materiales externamente
a la membrana citoplásmica, al mismo tiempo que se acumulan materiales de reserva en
el citoplasma. Poseen metabolismo endógeno, y resisten al calor, a la
desecación y a agentes químicos más que la correspondiente célula vegetativa (pero
menos que las endosporas).
Ejemplos:
- Quistes de Azotobacter
y Bdellovibrio.
- Microquistes de
Mixobacterias, llamados mixosporas: sus envueltas constan de una corteza, rodeada
de cubiertas (interna y externa). Estas cubiertas se componen de una glucoproteína muy
rica en polisacáridos.
En las cianobacterias filamentosas (que forman tricomas) se pueden
observar dos tipos principales de células diferenciadas a partir de las vegetativas:
heteroquistes y acinetos.
Heteroquistes (= heterocistes)
Son células de término, sin función reproductiva, especializadas
en la fijación de nitrógeno molecular (N2), de mayor tamaño que las
células vegetativas.
La conexión entre células vegetativas y heteroquistes se establece a
través de un estrangulamiento de los polos de éstas. La unión está atravesada por una
serie de finos canales llamados microplasmodesmos, que reducen al mínimo el
intercambio de sustancias entre ambas células.
Por fuera de la P.C. (que es de tipo Gram-negativo), existen tres
cubiertas:
- una capa laminada
interna a base de glucolípidos exclusivos de cianobacterias;
- una capa homogénea
central a base de polisacáridos;
- una capa fibrosa
externa, también polisacarídica, pero menos compactada.
Estas tres capas evitan la difusión del O2 al
interior del heteroquiste, lo que representa uno de los mecanismos para la protección
de la nitrogenasa (complejo enzimático que reduce el N2 a NH4+,
y que es muy sensible al oxígeno).
Pero el heteroquiste dispone de más "estrategias" para la
protección de la nitrogenasa:
- aparte de los
microplasmodesmos, en las uniones con las células vegetativas adyacentes se forman sendos
"tapones" de cianoficina;
- los tilacoides se
disponen como un retículo polar y periférico, y carecen de ficobilisomas, por lo
que no pueden realizar la fase II de la fotosíntesis. Por lo tanto, los
heteroquistes no generan oxígeno, ya que sólo realizan la fotofosforilación
cíclica.
Acinetos (=aquinetos)
Son formas de reposo que se originan a partir de células
vegetativas, por acumulación de nuevas capas de materiales polisacarídicos por fuera de
la pared celular, y por formación de acúmulos de reserva en el citoplasma.
Resisten más que las células vegetativas los períodos de desecación
y de congelación, pero no al calor.
Cuando las condiciones ambientales mejoran, se producen sucesivas
divisiones transversales en el acineto, que finalmente se convierte en un filamento más
corto y menos grueso que los tricomas, llamado hormogonio
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