Curso de Microbiología
General
de Enrique Iáñez
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CRECIMIENTO A NIVEL DE POBLACIONES
ÍNDICE
1. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES
BACTERIANAS
2. CRECIMIENTO BALANCEADO
3. CULTIVO CONTINUO
4. CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS
BARRA DE EXPLORACIÓN: Microbiología General
[ Principal ] [ Arriba ] [ Concepto e historia de la Microbiología ] [ Los microorganismos en el mundo vivo ] [ La célula procariota ] [ Curso de Microbiología General ] [ Biosíntesis y crecimiento de la pared celular ] [ Membrana citoplasmática y transporte de nutrientes ] [ Inclusiones citoplasmáticas ] [ Cuerpos nucleares. El genóforo bacteriano ] [ Expresión genética y exportación de proteínas ] [ Flagelos, fimbrias, prostecas ] [ Endosporas y otras diferenciaciones ] [ Crecimiento y division celular ] [ Crecimiento de poblaciones bacterianas ] [ Metabolismo energético bacteriano ] [ Desinfectantes y antisépticos ] [ Quimioterápicos y antibióticos ] [ Resistencia bacteriana a los antibióticos ] [ Regulación genética en las bacterias ] [ Mutación y supresión en bacterias ] [ Recombinación ] [ Transformación ] [ Transducción ] [ Conjugación bacteriana ] [ BIBLIOGRAFÍA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL ]
1. DETERMINACIÓN
DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS
El crecimiento de una
población o cultivo bacterianos se puede expresar en función de:
- aumento de masa del cultivo
- aumento del número de
células
Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento
balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad
de tiempo).
1.1 MEDIDA DE MASA
BACTERIANA
1.1.1 Métodos directos:
en estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.
1.1.1.1 Determinación del peso húmedo:
se tara un tubo de centrífuga;
se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
se determina el peso del sedimento.
Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular
retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa,
intensidad del empaquetamiento, etc.
1.1.1.2 Determinación del peso seco
: como el anterior, pero el
sedimento se seca antes de ser pesado (105oC, toda la noche), hasta peso
constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso
húmedo.
Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes
errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de
laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x109 bacterias.
1.1.1.3 Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.
1.1.14 Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN,
proteínas, etc
.
Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos
más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en
filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.
1.1.2 Métodos indirectos
1.1.2.1 Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por
unidad de tiempo
. Ejemplos: consumo de oxígeno (QO2) y consumo de
carbónico (QCO2), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de
ácidos.
1.1.2.2 Métodos turbidimétricos (ópticos).
La base común de
estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a
través de un cultivo bacteriano.
Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al
igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua. La dispersión de la luz es,
dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.
Medición de luz
transmitida:
A) Escala de
MacFarland: Se trata de una serie de patrones de
turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente
cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2
al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen
de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la
turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera
una turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de
turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente
cerrados que contienen {1% de Cl2Ba + cantidades crecientes de SO4H2
al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO4Ba, origen
de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la
turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera
una turbidez similar.
B) Espectrofotómetro
:
Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica.
Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.
D.O. = A = -logT/100
donde T= transmitancia
1.2 MEDIDA
DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS
1.2.1 Métodos
directos
1.2.1.1 Cámara de recuento de Petroff-Hauser
: Consiste en un
portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:
- excavación con 0.02 mm de
profundidad;
- área de 1 mm2,
dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
- cada cuadrado grande está
subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.
O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).
La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la
plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en
varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota
el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la
concentración celular es fácil de establecer:
n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.
Ventajas: es un método muy rápido
Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente
concentradas (>10x106 céls./ml). Por debajo de este valor el número de
células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo
estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una
mezcla de alcohol y agua.
1.2.1.2 Recuento en preparaciones teñidas
: Se dispone de un porta con
una excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre
esta excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y
tiñe por algún colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y
objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n
bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será:
n·At/Ac· 1/v
1.2.1.3 Recuento proporcional de Wright
: Se mezcla la
suspensión bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de
hematíes. La concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y
partículas observadas en el mismo campo microscópico. Este método se emplea más
frecuentemente en Virología.
1.2.1.4 Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter)
: Se
hace pasar una suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una
corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m m
diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es
recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño
de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del
pulso de voltaje al paso de la partícula). Recientemente se ha introducido la citometría
de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que las
partículas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal u otro ligando
específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una
molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.
1.2.2 Métodos
indirectos:
Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de totales).
1.2.2.1 Método del número más probable
: Su fundamento estriba
en la distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de
muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una
suspensión.
PX = mX · e-m/x!
donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración (no
partículas/volumen)
La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un
medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la
proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P0 (x = 0).
Entonces, según la distribución de Poisson:
P0= e--m
y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:
m = -lnP0
1.2.2.2 Recuento de viables en placa
: Como esta técnica
será explicada al alumno en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a
las pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento
más usadas en la rutina del laboratorio de Microbiología.
Precauciones:
- para minimizar los errores
estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilución;
- hay que usar pipetas nuevas en
cada dilución;
- contar las placas donde
existan entre 50 y 300 colonias.
1.2.2.3 Determinación de la proporción células viables/células totales
:
Si se está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos
en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de
células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables
(visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).
1.2.2.4 Recuento sobre filtros de nitrocelulosa
: Se usa para
suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través
de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el
filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se
forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función
del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.
2. CRECIMIENTO
BALANCEADO (= EQUILIBRADO)
Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se
mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal
que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, no de células, ADN,
ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:
D
M/M = D N/N = D
[ADN]/[ADN] = D [proteínas]/[proteínas] = ... = K
Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se
comporta como una reacción autocatalítica de primer orden:
velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}
También se puede decir que el no de células, la masa celular u otros
componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.
Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza,
pues, por ser el crecimiento en el que
- todos los constituyentes
celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera:
- aquel en el que estos
constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este
factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (m ),
que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.
2.1 Expresión
matemática del crecimiento balanceado:
Para deducirla vamos a aprovechar la definición empírica anterior, atendiendo por un
lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del número de individuos.
En función del aumento de masa celular:
Podemos decir que
[(dM/M)/dt] = m
por lo tantodM = M·m·dt
Si integramos, resulta:
M/M0 = em (t-t0)
Aplicando logaritmos neperianos:
Tenemos que ln[M/M0] = m (t-t0)
fórmula{14.1}
De aquí se puede deducir que el coeficiente m es
m
= lnM/M0 /(t-t0) fórmula{14.2}
En función del aumento del número de células.
Supongamos que partimos de
una célula. Tras una división (generación celular), tendremos 2, tras dos divisiones
tendremos 4, luego 8, etc:
serie geométrica. 1, 2, 22, 23, 24, ... 2n
(donde n es es número de generaciones transcurridas).
Si en vez de partir de una célula partimos de N0 células iniciales, la
expresión se convierte en:
N = N0·2n ; por lo tanto:
N/N0 = 2n ; . fórmula {14.3}
Por otro lado, el número de generaciones se puede calcular fácilmente teniendo en
cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generación (g):
Es n = (t-t0)/g
Sustituyendo esta expresión en la fórmula {14.3} tenemos:
N/N0 = 2(t-t0)/g
Apliquemos logaritmos neperianos:
Obtenemos que lnN/N0 = [(t-t0)/g ]· ln2 (fórmula
14.4)
Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones
matemáticas {14.1} y {14.4} que hemos deducido (la de la sección A, basada en masa, y la
de la sección B, basada en número de individuos) son equivalentes:
Por lo tanto, lnM/M0 = lnN/lnN0
m
= lnM/M0 /(t-t0) = [(t-t0)/g
]· ln2
m
= ln2/g = 0.693/g (expresado
en h--1)
Esta es la expresión matemática del coeficiente del crecimiento balanceado, en
función del tiempo medio de generación (g).
En un medio ideal, sin limitación de nutrientes, este coeficiente es m = m máx, o sea, el máximo
valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento
balanceado no restringido.
En un medio donde exista algún nutriente limitante (o sea, cuya concentración
está por debajo del límite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es
de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al
máximo, según la fórmula empírica siguiente:
m
=m máx [S]/(KS + [S])
donde [S] es la concentración del nutriente limitante; KS es la constante
de saturación, equivalente a la concentración de nutriente para la que el coeficiente es
semimáximo.
Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m ) es
una función hiperbólica de la concentración del sustratro (nutriente) limitante (ver
gráfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energía, fuente de N, de P,
un factor de crecimiento, etc.
- la KS para la
glucosa en E. coli es 1·10-6M
- la KS para el
triptófano en esta bacteria es 2·10--7 M
Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas
membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptación evolutivamente adquirida
de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que normalmente viven.
(Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen
ser más concentrados).
Como veremos en el apartado 4, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados
que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado
suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.
3. CULTIVO CONTINUO
Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se
compone de:
- una cámara de cultivo de
volumen constante,
- a la que llega un suministro
de nutrientes,
- y de la que se eliminan o
separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).
Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la
concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que
el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente.
Los parámetros a tener en cuenta son:
- flujo (f), medido en
ml/h
- volumen de la cámara de
cultivo (v, en ml)
- densidad celular en la cámara
(x)
- factor de dilución D = f/v
(en h--1). El inverso de este factor de dilución es el tiempo medio de
residencia (1/D= TMR)
Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D
El crecimiento bruto es dx/dt = x·m
Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x·m - x·D =
x·(m - D)
Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m ) se haga
igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de
células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico
de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias
por crecimiento.
Existen dos tipos de procedimientos para obtener cultivos continuos:
- de control interno:
turbidostato;
- de control externo:
quimiostato.
3.1 Turbidostato
Permite cultivos continuos con un coeficiente m cercano al m máx, trabajando a valores altos de D. Ello lo logra
ajustando los valores de densidad celular de modo que ningún factor nutricional se haga
limitante.
Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma concentración de
bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio de un mecanismo
electrónico basado en la medición y control de la densidad óptica del cultivo).
Para el mecanismo de su funcionamiento, por favor atender la
explicación en clase y consultar el esquema suministrado en la Fig.
Inconvenientes:
- es difícil de manejar y
ajustar;
- si las bacterias tienen
tendencia a adherirse a superficies (paredes internas del aparato), los resultados de
medida de la D.O. quedan falseados (infravalorados).
Aplicaciones: se emplea bastante en el estudio de los factores que incrementan o
disminuyen la tasa de crecimiento.
3.2 Quimiostato
Para introducirnos al funcionamiento del quimiostato, partamos de la observación de lo
que pasaría en el turbidostato si desconectamos el fotómetro y ajustamos la bomba 1 para
que vierta medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que mantiene la m cercana a la m máx:
las bacterias tenderían a crecer a mayor velocidad que su dilución debida a adición
de medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentaría la concentración de bacterias.
Pero este incremento no podría continuar indefinidamente. Pero el crecimiento tampoco
se detendría. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzaría un nuevo estado
estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace proporcional a
la tasa de adición de medio fresco. En este caso, el cultivo crece exponencialmente,
pero a tasas m <m máx.
Sigue creciendo exponencialmente porque la tasa de dilución del cultivo es una función
exponencial del tiempo.
La m submáxima viene determinada en el quimiostato por
la tasa de dilución (D). La cinética sigue siendo exponencial, ya que en el nuevo
estado estacionario de equilibrio la tasa de crecimiento compensa a la tasa de
dilución, que como sabemos, es una función exponencial.
Ventajas del quimiostato en comparación con el turbidostato:
En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de
tasas de crecimiento exponencial, mientras que, como vimos, en el turbidostato se
cultivan en un rango estrecho de valores de m cercanos al m máx.
El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe
un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente baja como para
limitar la densidad de población.
SR es la concentración de nutriente en el reservorio, y determina el valor
de S, que es la concentración de nutriente limitante en el recipiente de cultivo.
La tasa de adición de ese sustrato determina la tasa de crecimiento.
Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la
que se quiere trabajar.
Expresión matemática del quimiostato:
x = concentración celular en equilibrio
Y = constante de rendimiento en el medio empleado (masa de microorganismo formada/masa
de sustrato consumida)
SR= concentración del sustrato limitante en el reservorio
D = factor de dilución
KS= constante de saturación respecto del sustrato limitante
La fórmula nos dice que sabiendo Y, KS y m máx
se puede fijar la densidad celular (x) simplemente ajustando dos parámetros del aparato:
SR (concentración del sustrato o nutriente limitante en el reservorio)
D (coeficiente de dilución, regulable por el flujo)
Por otro lado, se puede demostrar también que la concentración de sustrato limitante
en equilibrio en la cámara de cultivo es:
S= KS·D/(m máx- D)
Esta fórmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la
concentración S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa
específica de crecimiento (m ).
Véase la gráfica compleja en el esquema, bajo el dibujo del quimiostato. Algunos
comentarios (atiéndase la explicación del profesor):
La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D).
Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor
de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el quimiostato puede
obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.
En cambio, a altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente,
y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (DC: dilución
crítica).
A muy bajas diluciones (DM) el quimiostato no funciona si el nutriente
limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de
energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no
queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energía de mantenimiento. Los
procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el
transporte de solutos y la renovación de proteínas.
Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:
Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica a procesos
industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos,
de aminoácidos, etc).
En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar:
- aspectos fisiológicos
(por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
- selección de mutantes
- estudios ecológicos.
4. CULTIVO EN
SISTEMAS CERRADOS
En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte
continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho.
En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura
sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la
acumulación de desechos.
NOTA:En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados
indefinidos. Hágase el alumno una idea de lo que es el crecimiento exponencial indefinido
de una bacteria a través de los siguientes datos: si una sola bacteria (que pesa 10--12
gramos) pudiera crecer sin restricción, con un tiempo de generación de 20 minutos, al
cabo de 48 horas la población derivada pesaría nada menos que 2,2 ·1031
gramos, equivalente a 4000 veces el peso de nuestro planeta.
4.1 CURVA DE
CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍQUIDO
El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:
Fase de retardo (fase "lag"): Es el período de tiempo durante el que el
inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado.
Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios
factores:
tamaño del inóculo;
bondad del inóculo (estado metabólico previo del inóculo):
si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo
anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros
constituyentes de las células son bajos, y las células deben reponerlos en el medio
fresco.
si las células están dañadas por algún agente, el lag también es
largo, ya que necesitan un tiempo para la reparación de los daños.
si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase
logarítmica, el lag es más corto.
medio del que procede el inóculo:
si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto;
si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más
pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo
adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas
en el medio rico.
Pero aun cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica,
cuyo medio sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. )Por qué?:
- necesidad de neutralizar
sustancias tóxicas en el medio fresco;
- porque se produce dilución de
ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo; por lo
tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentración de esos metabolitos adecuada
para el crecimiento, éste no "arranca".
Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrófica en un
medio ligeramente ácido, sometido a aireación: en un principio, se produce dilución de
CO2, por lo que se retardan reacciones de carboxilación que requieren este CO2,
y se produce un retardo.
Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a ...
Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica). La fase 2 se debe a que cada
célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello
demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones
fisiológicas.
Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante
unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es
característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:
El valor del tiempo de generación (g) depende de:
- composición del medio
- temperatura
- pH
- osmolaridad (tonicidad), etc.
Los microorganismos heterotrofos suelen crecer más rápidamente en los medios
complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con
glucosa que con otras fuentes de carbono.
Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a...
Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de
crecimiento se hace nulo (m = 0), pero aún existe
crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes
celulares.
En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho.
Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.
Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración
negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes
alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los
hidratos de carbono).
En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo
general es diferente al de la fase logarítmica:
- las células son más
pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el
incremento de masa;
- el citoplasma se condensa;
- en las bacterias
Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;
- el nucleoide se condensa, por
sustitución de ciertas proteínas que se unen a ADN;
- la membrana citoplásmica se
hace menos fluida;
- suelen ser más resistentes a
agentes físicos (temperatura, estrés osmótico) y químicos;
- existe un cambio en el patrón
de expresión genética: se desconectan cientos de genes que habían estado expresándose
durante la fase exponencial, mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban
reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima
de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad s38 (=sS).
- existe reciclado de ciertos
materiales intracelulares;
- baja el contenido en ARN.
Fase de transición hacia ...
Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo.
Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen
grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). La
pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias
entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).
4.2 CRECIMIENTO
DIÁUXICO
Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de
carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es
usada preferencialmente. Si representamos la cinética del crecimiento poblacional según
hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la figura
siguiente:
Obsérvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve
fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases
exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diáuxico.
Bases del crecimiento diáuxico:
La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la
glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin
"tocar" la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar
la segunda (ej.: lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas
catabólicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han
logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial,
aunque, como se puede constatar en el gráfico, con una pendiente menor (lo que significa
que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la
preferencial).
Pero esta explicación aún es "superficial": nos queda por estudiar su base
genética y molecular, que postergaremos hasta el capítulo
primero de la sección de Genética bacteriana.
4.3 CRECIMIENTO EN
SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS
Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a
un gel, que le da consistencia.
Los tipos de gelificantes usados para los medios sólidos:
- agar-agar (o simplemente,
agar): es el más comúnmente empleado;
- gelatina (inconveniente de que
se licúa a temperaturas relativamente bajas);
- silicagel (o gel de sílice):
tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautotrofos.
Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando
las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de
Petri (ver prácticas). Tras la incubación a la temperatura y condiciones
pertinentes, cada bacteria o agrupación bacteriana que ha quedado en un punto determinado
del medio da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a simple
vista, denominada colonia.
La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 células para una
colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio sólido, a diferencia del líquido,
las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un
aporte continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella),
y eliminación continua de productos de desecho (por difusión desde la colonia hacia
fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de
células.
Como el alumno comprobará en prácticas, cada especie bacteriana suele originar
colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la determinación
taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias
(caracteres culturales):
- tamaño (relativo)
- forma general
- forma de los bordes de la
colonia
- aspecto de la superficie y
elevación sobre el sustrato
- color
- consistencia, etc.
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BIBLIOGRAFÍA
LIBROS
NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial cell:
a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el
capítulo 7.
ARTICULOS DE REVISION
KOLTER, R. (1992): Life and death in stationary phase. ASM News 58: 75-79.
MEYER, H.-P., O. KÄPPELI, A. FIECHTER (1985): Growth control in microbial cultures.
Ann. Rev. Microbiol. 39: 299-319.
actualizado el 17 de agosto de 1998
Ó
1998 ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. Prohibida su reproducción, salvo con fines
educativos.
Se agradecen los comentarios y
sugerencias.
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