Ambos tipos de expresiones son equivalentes entre sí en cultivos que estén en crecimiento balanceado (en el que todos los componentes aumentan una misma proporción por unidad de tiempo).

1.1 MEDIDA DE MASA BACTERIANA

1.1.1 Métodos directos:

en estos métodos se requieren preparaciones limpias, sin partículas extrañas.

1.1.1.1 Determinación del peso húmedo:

se tara un tubo de centrífuga;
se centrifuga el cultivo y se elimina el sobrenadante;
se determina el peso del sedimento.

Inconvenientes: grandes errores, debido al líquido intercelular retenido, cuya cuantía depende a su vez de la forma y tipo de agrupaciones de la cepa, intensidad del empaquetamiento, etc.

1.1.1.2 Determinación del peso seco: como el anterior, pero el sedimento se seca antes de ser pesado (105^oC, toda la noche), hasta peso constante. Las medidas de peso seco suelen representar el 10-15% de los valores de peso húmedo.

Inconvenientes: método tedioso (requiere mucho tiempo) y con bastantes errores: es difícil pesar menos de 1 mg con exactitud en las balanzas habituales de laboratorio. 1 mg de peso seco equivale a unas 5x10⁹ bacterias.

1.1.1.3 Determinación del nitrógeno total: técnica de micro-Kjeldahl.

1.1.14 Determinación de un componente característico: peptidoglucano, ADN, ARN, proteínas, etc.

Comentarios: se suele usar en bacterias para las que otros métodos más fáciles dan errores debido a que forman grumos no dispersables, crecen en filamentos, etc. Se emplean en determinaciones de crecimientos en ambientes naturales.

1.1.2 Métodos indirectos

1.1.2.1 Medida de consumo de nutrientes o de producción de algún metabolito por unidad de tiempo . Ejemplos: consumo de oxígeno (QO₂) y consumo de carbónico (QCO₂), determinados por el respirómetro de Warburg. Producción de ácidos.

1.1.2.2 Métodos turbidimétricos (ópticos). La base común de estos métodos consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano.

Recordemos aquí que las suspensiones bacterianas dispersan la luz, al igual que cualquier partícula pequeña suspendida en agua. La dispersión de la luz es, dentro de ciertos límites, proporcional a la masa del cultivo.

Medición de luz transmitida:

A) Escala de MacFarland: Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl₂Ba + cantidades crecientes de SO₄H₂ al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO₄Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar. Se trata de una serie de patrones de turbidez previamente calibrados. Consiste en varios tubos de vidrio herméticamente cerrados que contienen {1% de Cl₂Ba + cantidades crecientes de SO₄H₂ al 1%}; por lo tanto, en cada tubo se origina un precipitado de SO₄Ba, origen de la turbidez. Para cada cepa bacteriana hay que establecer la equivalencia entre la turbidez de cada tubo y la masa o la concentración de bacterias (en céls/ml) que genera una turbidez similar.

Inconveniente: es un método poco preciso, que sólo se emplea cuando no hace falta exactitud. Ha sido desplazado por los métodos espectrofotométricos.

B) Espectrofotómetro: Este aparato es de uso habitual en cualquier laboratorio de Microbiología o Bioquímica. Mide la densidad óptica (D.O.), es decir la absorbancia.

D.O. = A = -logT/100

donde T= transmitancia

Por supuesto, hay que realizar una curva estándar para relacionar los valores de A con la masa bacteriana.

Comentarios: La cantidad de luz dispersada es proporcional al cociente entre el tamaño de la partícula y la longitud de onda incidente; la sensibilidad de la técnica aumenta pues a longitudes de onda (l ) cortas. La proporcionalidad entre A y masa bacteriana sólo es válida para >10⁷céls/ml.

C) Nefelómetro: Es un aparato similar al anterior, pero el dispositivo sensor está situado en ángulo recto respecto de la dirección de la luz incidente, y lo que se mide es pues, la luz dispersada directamente por la preparación. Posee mayor sensibilidad que el espectrofotómetro.

1.2 MEDIDA DEL NÚMERO DE INDIVIDUOS

1.2.1 Métodos directos

1.2.1.1 Cámara de recuento de Petroff-Hauser: Consiste en un portaobjetos especial con una graduación en superficie y unas medidas muy concretas:

excavación con 0.02 mm de profundidad;
área de 1 mm², dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes;
cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 4x4 = 16 cuadrados pequeños.

O sea, la muestra se distribuye en 16X25 = 400 celdillas (cuadros pequeños).

La muestra, una vez dispensada entre el porta y el cubre, se deja reposar sobre la plataforma del microscopio durante unos minutos, y se cuenta el número de células en varias celdillas (normalmente en 16, equivalentes a uno de los cuadros grandes). Se anota el número n de células observadas en esas 16 celdillas. Entonces, la concentración celular es fácil de establecer:

n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células/ml.

Ventajas: es un método muy rápido

Inconvenientes: sólo sirve para suspensiones relativamente concentradas (>10x10⁶ céls./ml). Por debajo de este valor el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo estadísticamente. En bacterias móviles, hay que inmovilizarlas previamente, con una mezcla de alcohol y agua.

1.2.1.2 Recuento en preparaciones teñidas: Se dispone de un porta con una excavación circular (de área At) con un volumen conocido (v). Sobre esta excavación se extiende la muestra con asa de siembra o con micropipeta, y se fija y tiñe por algún colorante. Se observa con un microscopio dotado de un juego de ocular y objetivo que delimitan un área de campo (Ac). Si en dicho campo se cuentan n bacterias, la concentración de bacterias por mililitro será:

n·At/Ac· 1/v

1.2.1.3 Recuento proporcional de Wright: Se mezcla la suspensión bacteriana problema con una cantidad conocida de bolitas de látex o de hematíes. La concentración bacteriana se deduce de la proporción de bacterias y partículas observadas en el mismo campo microscópico. Este método se emplea más frecuentemente en Virología.

1.2.1.4 Contadores electrónicos de partículas (tipo Coulter): Se hace pasar una suspensión bacteriana por un tubo capilar, entre los dos polos de una corriente eléctrica. Cada vez que por un orificio (30 m m diámetro) pasa una partícula (p. ej., bacteria) se interrumpe la corriente, lo cual es recogido por un dispositivo de registro electrónico, que detecta el número y el tamaño de las partículas que van pasando. (El tamaño detectado es función de la intensidad del pulso de voltaje al paso de la partícula). Recientemente se ha introducido la citometría de flujo activada por fluorescencia (FACS). Es una sofisticada modificación en la que las partículas a contar se marcan previamente con un anticuerpo monoclonal u otro ligando específico hacia alguna molécula de superficie, unidos a su vez a un fluorocromo, una molécula que emite fluorescencia al incidir sobre ella un haz de luz láser.

1.2.2 Métodos indirectos:

Son métodos que miden el número de bacterias viables (que no equivale al de totales).

1.2.2.1 Método del número más probable: Su fundamento estriba en la distribución de Poisson: una distribución aleatoria de partículas en una serie de muestras iguales, en función del número medio de partículas presentes en una suspensión.

P_X= m^X · e^-m/x!

donde x = número real de partículas en cada muestra y m = concentración (n^o partículas/volumen)

La técnica consiste en sembrar alícuotas de la suspensión original problema sobre un medio líquido o sólido adecuado; tras el tiempo de incubación adecuado se anota la proporción obtenida de muestras donde no se haya dado crecimiento, P₀ (x = 0). Entonces, según la distribución de Poisson:

P₀= e^--m

y por lo tanto es fácil calcular el valor de m:

m = -lnP₀

1.2.2.2 Recuento de viables en placa: Como esta técnica será explicada al alumno en clase, y además la realizará en las prácticas, remitimos a las pertinentes explicaciones "en vivo". Es una de las técnicas de recuento más usadas en la rutina del laboratorio de Microbiología.

Precauciones:

para minimizar los errores estadísticos de muestreo, se recomienda sembrar 5 placas de cada dilución;
hay que usar pipetas nuevas en cada dilución;
contar las placas donde existan entre 50 y 300 colonias.

1.2.2.3 Determinación de la proporción células viables/células totales: Si se está interesado en conocer esa proporción se recurre a una técnica de microcultivos en cubreobjetos: hay que seguir periódicamente la evolución del crecimiento de células individuales y determinar la proporción de aquellas células no viables (visibles al microscopio, pero incapaces de crecer).

1.2.2.4 Recuento sobre filtros de nitrocelulosa: Se usa para suspensiones diluidas de bacterias. Se hace pasar un gran volumen de suspensión a través de una membrana de nitrocelulosa estéril, que retiene las bacterias. Posteriormente, el filtro se deposita sobre la superficie de un medio de cultivo sólido. Las colonias se forman sobre el filtro y se cuentan, deduciéndose la concentración original en función del volumen de suspensión que se hizo pasar por el filtro.

2. CRECIMIENTO BALANCEADO (= EQUILIBRADO)

Una población de bacterias que se encuentre en un medio adecuado en el que se mantienen constantes todos sus parámetros nutricionales y ambientales, crece de forma tal que el incremento por unidad de tiempo de masa celular, n^o de células, ADN, ARN, proteínas, etc., es un valor constante y similar en cada caso:

D M/M = D N/N = D [ADN]/[ADN] = D [proteínas]/[proteínas] = ... = K

Así pues, durante este crecimiento, de tipo exponencial o logarítmico, el cultivo se comporta como una reacción autocatalítica de primer orden:

velocidad de aumento del componente = K·{cantidad del componente}

También se puede decir que el n^o de células, la masa celular u otros componentes se duplican en un mismo lapso de tiempo determinado.

Este tipo de crecimiento se denomina balanceado o equilibrado. Se caracteriza, pues, por ser el crecimiento en el que

todos los constituyentes celulares se duplican en un mismo tiempo, o dicho de otra manera:
aquel en el que estos constituyentes aumentan proporcionalmente por un mismo factor en la unidad de tiempo. Este factor es el coeficiente exponencial de crecimiento (m ), que es característico para cada cepa bacteriana en cada medio determinado.

2.1 Expresión matemática del crecimiento balanceado:

Para deducirla vamos a aprovechar la definición empírica anterior, atendiendo por un lado al aumento de la masa celular, y por otro al incremento del número de individuos.

En función del aumento de masa celular:

Podemos decir que

[(dM/M)/dt] = m

por lo tantodM = M·m·dt

Si integramos, resulta:

M/M₀ = em ^(t-t0)

Aplicando logaritmos neperianos:

Tenemos que ln[M/M₀] = m (t-t₀) fórmula{14.1}

De aquí se puede deducir que el coeficiente m es

m = lnM/M₀ /(t-t₀) fórmula{14.2}

En función del aumento del número de células. Supongamos que partimos de una célula. Tras una división (generación celular), tendremos 2, tras dos divisiones tendremos 4, luego 8, etc:

serie geométrica. 1, 2, 2², 2³, 2⁴, ... 2ⁿ (donde n es es número de generaciones transcurridas).

Si en vez de partir de una célula partimos de N₀ células iniciales, la expresión se convierte en:

N = N₀·2ⁿ ; por lo tanto:

N/N₀ = 2ⁿ ; . fórmula {14.3}

Por otro lado, el número de generaciones se puede calcular fácilmente teniendo en cuenta el tiempo transcurrido y conociendo el tiempo medio de generación (g):

Es n = (t-t₀)/g

Sustituyendo esta expresión en la fórmula {14.3} tenemos:

N/N₀ = 2^(t-t0)/g

Apliquemos logaritmos neperianos:

Obtenemos que lnN/N₀ = [(t-t₀)/g ]· ln2 (fórmula 14.4)

Ahora bien, como estamos ante un crecimiento balanceado, las dos expresiones matemáticas {14.1} y {14.4} que hemos deducido (la de la sección A, basada en masa, y la de la sección B, basada en número de individuos) son equivalentes:

Por lo tanto, lnM/M₀ = lnN/lnN₀

m = lnM/M₀ /(t-t₀) = [(t-t₀)/g ]· ln2

m = ln2/g = 0.693/g (expresado en h^--1)

Esta es la expresión matemática del coeficiente del crecimiento balanceado, en función del tiempo medio de generación (g).

En un medio ideal, sin limitación de nutrientes, este coeficiente es m = m _máx, o sea, el máximo valor posible del coeficiente para esa cepa en ese medio. Es decir, es un crecimiento balanceado no restringido.

En un medio donde exista algún nutriente limitante (o sea, cuya concentración está por debajo del límite de eficiencia de las permeasas), el crecimiento balanceado es de tipo restringido, de modo que el coeficiente real de crecimiento es inferior al máximo, según la fórmula empírica siguiente:

m =m _máx [S]/(K_S + [S])

donde [S] es la concentración del nutriente limitante; K_S es la constante de saturación, equivalente a la concentración de nutriente para la que el coeficiente es semimáximo.

Como se puede ver, la tasa de crecimiento (medida por m ) es una función hiperbólica de la concentración del sustratro (nutriente) limitante (ver gráfico). Este sustrato puede ser una fuente de C y/o de energía, fuente de N, de P, un factor de crecimiento, etc.

Ejemplos de K_S:

la K_S para la glucosa en E. coli es 1·10^-6M
la K_S para el triptófano en esta bacteria es 2·10^--7 M

Estos bajos valores se deben a la alta afinidad de las permeasas membrana hacia los sustratos, lo cual es una adaptación evolutivamente adquirida de las bacterias a los medios muy diluidos en nutrientes en los que normalmente viven. (Por el contrario, los medios de laboratorio donde se suelen cultivar las bacterias suelen ser más concentrados).

Como veremos en el apartado 4, en la naturaleza, y en los sistemas de cultivo cerrados que habitualmente se emplean en laboratorio, tarde o temprano el crecimiento balanceado suele terminar, debido a que se agotan los nutrientes o se acumulan sustancias de desecho.

3. CULTIVO CONTINUO

Es un cultivo balanceado mantenido por tiempo indefinido por un sistema de flujo que se compone de:

una cámara de cultivo de volumen constante,
a la que llega un suministro de nutrientes,
y de la que se eliminan o separan los productos tóxicos de desecho (por un dispositivo de rebosadero).

Una vez que el sistema alcanza el equilibrio, el número de células y la concentración de nutrientes en la cámara permanecen constantes, y entonces se dice que el sistema está en estado estacionario, con las células creciendo exponencialmente.

Los parámetros a tener en cuenta son:

flujo (f), medido en ml/h
volumen de la cámara de cultivo (v, en ml)
densidad celular en la cámara (x)
factor de dilución D = f/v (en h^--1). El inverso de este factor de dilución es el tiempo medio de residencia (1/D= TMR)

Existe una pérdida de células por el rebosadero: -dx/dt = x·D

El crecimiento bruto es dx/dt = x·m

Por lo tanto, el crecimiento neto es dx/dt = x·m - x·D = x·(m - D)

Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m ) se haga igual al factor de dilución (D), entonces dx/dt = 0, y por lo tanto la concentración de células se hace constante (x= x). El cultivo se encuentra entonces en estado dinámico de equilibrio. Las pérdidas de células por drenaje se compensan con las ganancias por crecimiento.

Existen dos tipos de procedimientos para obtener cultivos continuos:

de control interno: turbidostato;
de control externo: quimiostato.

3.1 Turbidostato

Permite cultivos continuos con un coeficiente m cercano al m _máx, trabajando a valores altos de D. Ello lo logra ajustando los valores de densidad celular de modo que ningún factor nutricional se haga limitante.

Se dice que es un sistema de control interno porque es la misma concentración de bacterias la que regula el flujo de entrada y de salida (por medio de un mecanismo electrónico basado en la medición y control de la densidad óptica del cultivo).

Para el mecanismo de su funcionamiento, por favor atender la explicación en clase y consultar el esquema suministrado en la Fig.

Inconvenientes:

es difícil de manejar y ajustar;
si las bacterias tienen tendencia a adherirse a superficies (paredes internas del aparato), los resultados de medida de la D.O. quedan falseados (infravalorados).

Aplicaciones: se emplea bastante en el estudio de los factores que incrementan o disminuyen la tasa de crecimiento.

3.2 Quimiostato

Para introducirnos al funcionamiento del quimiostato, partamos de la observación de lo que pasaría en el turbidostato si desconectamos el fotómetro y ajustamos la bomba 1 para que vierta medio fresco al cultivo a una tasa (flujo) menor que el que mantiene la m cercana a la m _máx:

las bacterias tenderían a crecer a mayor velocidad que su dilución debida a adición de medio fresco; por lo tanto, en un principio aumentaría la concentración de bacterias.

Pero este incremento no podría continuar indefinidamente. Pero el crecimiento tampoco se detendría. De hecho, tras un cierto tiempo, el cultivo alcanzaría un nuevo estado estacionario de equilibrio, en el que la tasa de crecimiento se hace proporcional a la tasa de adición de medio fresco. En este caso, el cultivo crece exponencialmente, pero a tasas m <m _máx. Sigue creciendo exponencialmente porque la tasa de dilución del cultivo es una función exponencial del tiempo.

La m submáxima viene determinada en el quimiostato por la tasa de dilución (D). La cinética sigue siendo exponencial, ya que en el nuevo estado estacionario de equilibrio la tasa de crecimiento compensa a la tasa de dilución, que como sabemos, es una función exponencial.

Ventajas del quimiostato en comparación con el turbidostato:

En un quimiostato, los microorganismos pueden cultivarse a una amplia variedad de tasas de crecimiento exponencial, mientras que, como vimos, en el turbidostato se cultivan en un rango estrecho de valores de m cercanos al m _máx.

El quimiostato permite crecimientos balanceados restringidos debido a que existe un nutriente o sustrato presente en una concentración suficientemente baja como para limitar la densidad de población.

S_R es la concentración de nutriente en el reservorio, y determina el valor de S, que es la concentración de nutriente limitante en el recipiente de cultivo.

La tasa de adición de ese sustrato determina la tasa de crecimiento.

Así pues, el quimiostato también permite elegir la densidad de células a la que se quiere trabajar.

Expresión matemática del quimiostato:

x = concentración celular en equilibrio

Y = constante de rendimiento en el medio empleado (masa de microorganismo formada/masa de sustrato consumida)

S_R= concentración del sustrato limitante en el reservorio

D = factor de dilución

K_S= constante de saturación respecto del sustrato limitante

La fórmula nos dice que sabiendo Y, K_S y m _máx se puede fijar la densidad celular (x) simplemente ajustando dos parámetros del aparato:

S_R (concentración del sustrato o nutriente limitante en el reservorio)

D (coeficiente de dilución, regulable por el flujo)

Por otro lado, se puede demostrar también que la concentración de sustrato limitante en equilibrio en la cámara de cultivo es:

S= K_S·D/(m _máx- D)

Esta fórmula nos dice que el efecto principal de cambiar el flujo (D) es alterar la concentración S de sustrato limitante en el cultivo, lo que a su vez afecta a la tasa específica de crecimiento (m ).

Véase la gráfica compleja en el esquema, bajo el dibujo del quimiostato. Algunos comentarios (atiéndase la explicación del profesor):

La densidad del cultivo es muy similar en un amplio margen de tasas de dilución (D). Este margen es el más adecuado para hacer estudios en el quimiostato. En cambio, el valor de tiempo de generación (g) varía ampliamente. O sea, el quimiostato puede obtener tasas de crecimiento muy diferentes, sin que se afecte la densidad celular.

En cambio, a altas tasas de dilución la concentración microbiana cambia rápidamente, y en un margen estrecho el cultivo puede drenarse totalmente (D_C: dilución crítica).

A muy bajas diluciones (D_M) el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es la fuente de energía. Ello se debe a que en esas condiciones, la fuente de energía sólo se usa para reacciones de mantenimiento de la integridad celular, pero no queda para el crecimiento. A este valor lo llamamos energía de mantenimiento. Los procesos relacionados con esta energía de mantenimiento son el potencial de membrana, el transporte de solutos y la renovación de proteínas.

Aplicaciones del cultivo continuo en quimiostato:

Aportan una fuente continua de células en fase exponencial, lo que se aplica a procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de antibióticos, de aminoácidos, etc).

En el quimiostato, el crecimiento a bajas concentraciones de sustrato permite estudiar:

aspectos fisiológicos (por ejemplo, catabolismo del sustrato limitante);
selección de mutantes
estudios ecológicos.

4. CULTIVO EN SISTEMAS CERRADOS

En los sistemas cerrados (que pueden ser líquidos o sólidos), no existe aporte continuo de nutrientes, ni drenaje de células ni de sustancias de desecho.

En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento balanceado no restringido dura sólo unas cuantas generaciones, debido al agotamiento de nutrientes y/o a la acumulación de desechos.

NOTA:En la naturaleza no es normal ver crecimientos balanceados indefinidos. Hágase el alumno una idea de lo que es el crecimiento exponencial indefinido de una bacteria a través de los siguientes datos: si una sola bacteria (que pesa 10^--12 gramos) pudiera crecer sin restricción, con un tiempo de generación de 20 minutos, al cabo de 48 horas la población derivada pesaría nada menos que 2,2 ·10³¹ gramos, equivalente a 4000 veces el peso de nuestro planeta.

4.1 CURVA DE CRECIMIENTO EN UN SISTEMA CERRADO EN MEDIO LÍQUIDO

El crecimiento en un sistema cerrado consta de varias fases, que pasamos a comentar:

Fase de retardo (fase "lag"): Es el período de tiempo durante el que el inóculo se adapta a las condiciones del medio fresco sobre el que se ha sembrado. Se trata de un período de ajuste metabólico. Su duración depende de varios factores:

tamaño del inóculo;

bondad del inóculo (estado metabólico previo del inóculo):

si el inóculo procede de células en fase estacionaria de un cultivo anterior, la fase lag es larga. Ello se debe a que los contenidos en coenzimas y otros constituyentes de las células son bajos, y las células deben reponerlos en el medio fresco.

si las células están dañadas por algún agente, el lag también es largo, ya que necesitan un tiempo para la reparación de los daños.

si las células del inóculo se tomaron de un cultivo previo en fase logarítmica, el lag es más corto.

medio del que procede el inóculo:

si el medio es similar al medio fresco, el lag es más corto;

si el medio del inóculo era un medio rico y el medio fresco es más pobre, la fase de retardo se hace más larga, porque las bacterias necesitan un tiempo adicional para activar la síntesis de las enzimas biosintéticas que estaban reprimidas en el medio rico.

Pero aun cuando la inoculación se hace desde un cultivo previo en fase logarítmica, cuyo medio sea idéntico al medio fresco, se observa siempre una fase lag. )Por qué?:

necesidad de neutralizar sustancias tóxicas en el medio fresco;
porque se produce dilución de ciertos metabolitos intracelulares al inocular las bacterias en el medio nuevo; por lo tanto, hasta que no se vuelva a alcanzar una concentración de esos metabolitos adecuada para el crecimiento, éste no "arranca".

Ejemplo: Supongamos que inoculamos una bacteria heterotrófica en un medio ligeramente ácido, sometido a aireación: en un principio, se produce dilución de CO₂, por lo que se retardan reacciones de carboxilación que requieren este CO₂, y se produce un retardo.

Fase de transición, de crecimiento acelerado, que conduce a ...

Fase de crecimiento exponencial (= fase logarítmica). La fase 2 se debe a que cada célula entra en la fase exponencial con desfase respecto de sus compañeras. Ello demuestra que las células del inóculo no están todas en las mismas condiciones fisiológicas.

Durante la fase logarítmica se da un crecimiento balanceado no restringido durante unas pocas generaciones (normalmente menos de 10). El tiempo de generación (g) es característico para cada especie o cepa, en cada medio concreto:

El valor del tiempo de generación (g) depende de:

composición del medio
temperatura
pH
osmolaridad (tonicidad), etc.

Los microorganismos heterotrofos suelen crecer más rápidamente en los medios complejos, ricos, que en los medios sintéticos, y dentro de estos últimos, mejor con glucosa que con otras fuentes de carbono.

Fase de aceleración negativa, de crecimiento desequilibrado, que conduce a...

Fase estacionaria: Esta fase se caracteriza porque el coeficiente neto de crecimiento se hace nulo (m = 0), pero aún existe crecimiento. Lo que ocurre es que el crecimiento bruto se equilibra con las muertes celulares.

En este período se agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho. Incluso el pH del medio empieza a hacerse inadecuado para el crecimiento celular.

Si la bacteria crece en un medio complejo, la fase 4 de transición (de aceleración negativa) puede ser relativamente larga, debido a que va recurriendo a fuentes alternativas (p. ej., puede recurrir a aminoácidos como fuente de C una vez agotados los hidratos de carbono).

En la fase estacionaria aún existen reacciones metabólicas, pero el metabolismo general es diferente al de la fase logarítmica:

las células son más pequeñas, debido a que existe división celular después de que se haya detenido el incremento de masa;
el citoplasma se condensa;
en las bacterias Gram-negativas aumenta el volumen relativo del periplasma;
el nucleoide se condensa, por sustitución de ciertas proteínas que se unen a ADN;
la membrana citoplásmica se hace menos fluida;
suelen ser más resistentes a agentes físicos (temperatura, estrés osmótico) y químicos;
existe un cambio en el patrón de expresión genética: se desconectan cientos de genes que habían estado expresándose durante la fase exponencial, mientras que se activan unos 50-100 genes que antes estaban reprimidos (genes de fase estacionaria); estos genes se transcriben mediante la holoenzima de la ARN-polimerasa dotada de la subunidad s³⁸ (=s^S).
existe reciclado de ciertos materiales intracelulares;
baja el contenido en ARN.

Fase de transición hacia ...

Fase de muerte exponencial: Se da muerte y lisis masiva, exponencial, del cultivo. Se debe a agotamiento de reservas de energía. Algunas veces las células aparecen grandes, hinchadas, distorsionadas (formas "fantasmas", "ghost"). La pendiente de esta parte de la curva depende de las especies (por ejemplo, en bacterias entéricas es suave, mientras que en Bacillus es más acentuada).

4.2 CRECIMIENTO DIÁUXICO

Supongamos que inoculamos una bacteria en un medio líquido provisto de dos fuentes de carbono (p. ej., glucosa y lactosa), de las cuales una (en este ejemplo, la glucosa) es usada preferencialmente. Si representamos la cinética del crecimiento poblacional según hemos aprendido en el apartado anterior, obtenemos una curva como la de la figura siguiente:

Obsérvese que se dan dos fases de crecimiento exponencial separadas por una breve fase intermedia estacionaria. Esta modalidad de crecimiento con dos fases exponenciales se conoce con el nombre de crecimiento diáuxico.

Bases del crecimiento diáuxico:

La bacteria usa en primer lugar sólo la fuente preferencial de C (en este caso, la glucosa, que suele ser la fuente preferencial en muchos heterotrofos), sin "tocar" la otra fuente. Una vez que agota la primera fuente, se dispone a usar la segunda (ej.: lactosa), pero tarda un tiempo hasta que sintetiza los enzimas catabólicos necesarios para degradar esa segunda fuente. Cuando las bacterias han logrado niveles de esos enzimas adecuados, se restablece el crecimiento exponencial, aunque, como se puede constatar en el gráfico, con una pendiente menor (lo que significa que esta fuente alternativa permite una tasa m menor que la preferencial).

Pero esta explicación aún es "superficial": nos queda por estudiar su base genética y molecular, que postergaremos hasta el capítulo primero de la sección de Genética bacteriana.

4.3 CRECIMIENTO EN SISTEMAS CERRADOS EN MEDIOS SÓLIDOS

Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero incorporado a un gel, que le da consistencia.

Los tipos de gelificantes usados para los medios sólidos:

agar-agar (o simplemente, agar): es el más comúnmente empleado;
gelatina (inconveniente de que se licúa a temperaturas relativamente bajas);
silicagel (o gel de sílice): tedioso de preparar. Uso casi exclusivo para quimioautotrofos.

Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula, diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en recipientes adecuados, como las placas de Petri (ver prácticas). Tras la incubación a la temperatura y condiciones pertinentes, cada bacteria o agrupación bacteriana que ha quedado en un punto determinado del medio da origen, por crecimiento, a una acumulación de células, visible a simple vista, denominada colonia.

La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 10⁷ células para una colonia de unos 5 mm). Esto se debe a que en el medio sólido, a diferencia del líquido, las bacterias no pueden dispersarse, y durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de nutrientes (por difusión desde el entorno de la colonia, hacia ella), y eliminación continua de productos de desecho (por difusión desde la colonia hacia fuera). Por lo tanto, se parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.

Como el alumno comprobará en prácticas, cada especie bacteriana suele originar colonias de un tipo determinado, en cada medio concreto. Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie de características de las colonias (caracteres culturales):

tamaño (relativo)
forma general
forma de los bordes de la colonia
aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato
color
consistencia, etc.

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BIBLIOGRAFÍA

LIBROS

NEIDHART, F.C., J.L. INGRAHAM, M. SCHAECHTER (1990): Physiology of the bacterial cell: a molecular approach. Sinauer Associates, Sunderland, Massachusetts. Consultar el capítulo 7.

ARTICULOS DE REVISION

KOLTER, R. (1992): Life and death in stationary phase. ASM News 58: 75-79.

MEYER, H.-P., O. KÄPPELI, A. FIECHTER (1985): Growth control in microbial cultures. Ann. Rev. Microbiol. 39: 299-319.

actualizado el 17 de agosto de 1998

Ó 1998 ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. Prohibida su reproducción, salvo con fines educativos.

Se agradecen los comentarios y sugerencias.

Escríbame a eianez@goliat.ugr.es

Curso de Microbiología General

de Enrique Iáñez

CRECIMIENTO A NIVEL DE POBLACIONES

ÍNDICE

1. DETERMINACIÓN DEL CRECIMIENTO DE POBLACIONES BACTERIANAS