Curso de
Microbiología General
de Enrique
Iáñez
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VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS CON TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO.
MUTACIÓN. SUPRESIÓN
ÍNDICE:
1 INTRODUCCIÓN A LAS VARIACIONES HEREDITARIAS NO ASOCIADAS A
TRANSFERENCIA DE MATERIAL GENÉTICO *
2 MUTACIONES ESPONTÁNEAS. *
2.1 MUTACIONES PUNTUALES
2.1.1 BASE MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES *
2.1.2 CONSECUENCIAS POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL *
2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE (=DEL MARCO O PAUTA) DE
LECTURA ["FRAMESHIFTS"] *
2.3 GRANDES DELECCIONES (O BORRADURAS): *
2.4 INVERSIONES: *
2.5 TRANSLOCACIONES: *
2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM *
2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES *
3 CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES *
4 DEMOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS *
5 TASA DE MUTACIÓN *
6 REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS *
6.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS *
6.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS *
6.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES *
7 AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES *
7.1 AGENTES FÍSICOS *
7.1.1 RADIACIÓN UV *
7.1.2 RAYOS X Y RADIACIONES IONIZANTES *
7.2 AGENTES QUÍMICOS *
7.2.1 ANÁLOGOS DE BASES *
7.2.2 AGENTES DESAMINANTES O HIDROXILANTES *
7.2.3 AGENTES ALQUILANTES *
7.2.4 SUSTANCIAS INTERCALANTES *
7.2.5 AGENTES QUE BLOQUEAN TOTALMENTE EL EMPAREJAMIENTO DE BASES *
8 LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE
CARCINOGÉNICAS *
9 ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO *
9.1 ALGUNOS CONCEPTOS BASICOS *
9.2 TIPOS Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO *
9.2.1 MUTACIONES QUE AFECTAN A RASGOS MORFOLÓGICOS DE LAS COLONIAS: *
9.2.2 MUTACIONES QUE AFECTAN A REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES *
9.2.3 MUTANTES RESISTENTES A DROGAS Y A FAGOS *
9.2.4 MUTANTES AFECTADOS EN EL USO DE AZÚCARES U OTRAS FUENTES DE C
Y ENERGÍA *
10 VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE PLÁSMIDOS *
BIBLIOGRAFIA *
BARRA DE EXPLORACIÓN: Microbiología General
[ Principal ] [ Arriba ] [ Concepto e historia de la Microbiología ] [ Los microorganismos en el mundo vivo ] [ La célula procariota ] [ Curso de Microbiología General ] [ Biosíntesis y crecimiento de la pared celular ] [ Membrana citoplasmática y transporte de nutrientes ] [ Inclusiones citoplasmáticas ] [ Cuerpos nucleares. El genóforo bacteriano ] [ Expresión genética y exportación de proteínas ] [ Flagelos, fimbrias, prostecas ] [ Endosporas y otras diferenciaciones ] [ Crecimiento y division celular ] [ Crecimiento de poblaciones bacterianas ] [ Metabolismo energético bacteriano ] [ Desinfectantes y antisépticos ] [ Quimioterápicos y antibióticos ] [ Resistencia bacteriana a los antibióticos ] [ Regulación genética en las bacterias ] [ Mutación y supresión en bacterias ] [ Recombinación ] [ Transformación ] [ Transducción ] [ Conjugación bacteriana ] [ BIBLIOGRAFÍA DE MICROBIOLOGÍA GENERAL ]
INTRODUCCIÓN GENERAL A LOS SIGUIENTES TEMAS:
VARIACIONES
BACTERIANAS ASOCIADAS A CAMBIOS EN EL GENOTIPO
Los diversos cambios morfológicos, estructurales y funcionales
ocurridos a lo largo de la evolución de los seres vivos tienen como base los cambios en
los genotipos, que esencialmente pueden ser de dos tipos:
- mutaciones. pesar de
que el mecanismo de la herencia genética es fiel y tiende a la conservación, esta
fidelidad no es absoluta e inflexible. Las mutaciones son cambios bruscos ocurridos en el
genotipo, y que son transmitidos a las generaciones siguientes.
- recombinaciones
subsiguientes a intercambio genético.En la mayoría de los eucariotas, pueden ocurrir
recombinaciones entre genotipos individuales de una misma población. En los fenómenos de
sexualidad se origina una variedad casi infinita de nuevas ordenaciones o genotipos, sin
necesidad del aporte de nuevas mutaciones. Ello suministra una materia prima sobre la que
puede actuar la selección, de modo que las poblaciones pueden ir evolucionando con el
paso del tiempo, en función de presiones ambientales.
¿Qué ocurre en bacterias?
- Los procariotas son organismos
con tiempos cortos de generación: se reproducen rápidamente y pueden dar origen en poco
tiempo a grandes poblaciones. Por supuesto, experimentan fenómenos de mutación, por lo
que las poblaciones pueden acumular gran número de mutaciones. Estudiaremos la mutación
(y los modos posibles de su eliminación) en el presente capítulo.
- Pero la mutación no es el
único tipo de variación genotípica en bacterias. Aunque los procariotas carecen de
fenómenos de sexualidad auténtica, existen variaciones genéticas asociadas a la
adquisición por una bacteria de parte del material genético de otra bacteria o de un
bacteriófago. Los posibles mecanismos de transferencia de información genética
entre bacterias son:
- transformación (que
estudiaremos en el capítulo 25);
- transducción (ver capítulo 26);
- conjugación (ver capítulo 27).
Los fenómenos de recombinación genética asociados a la transferencia
serán abordados en el capítulo 24.
Definiciones
iniciales:
Desde un mero punto de vista fenotípico, mutación es la
aparición brusca y espontánea de una variación fenotípica de un individuo, la cual se
transmite hereditariamente a la progenie.
Pero tras el descubrimiento del ADN como material de la herencia,
podemos plasmar una definición más ajustada, desde el punto de vista genotípico:
- Mutación es cualquier
alteración de la secuencia de bases de un segmento de ADN correspondiente a un gen o a un
locus (sea éste transcribible o no), aun cuando esta alteración no se refleje en forma
de cambio fenotípico observable o detectable.
- Alelo es cada una de
las distintas versiones en que puede presentarse un gen.
alelo silvestre: "forma" (secuencia) de un gen en las
bacterias aisladas de su hábitat natural (estirpes silvestres). En la naturaleza es muy
frecuente la existencia de polimorfismo:existen diversos alelos silvestres
diferentes para un mismo locus.
alelos mutantes: las distintas "formas" (secuencias)
que resultan de mutaciones del alelo silvestre.
- Mutaciones espontáneas:
son resultado de la actividad normal de la célula, o de sus interacciones con su medio
natural. La mayoría aparecen por errores en los procesos de replicación, reparación o
recombinación del ADN. (O sea, para abreviar, serían aquellas mutaciones no provocadas
de forma experimental).
- Mutaciones inducidas:
aquellas provocadas por previa alteración experimental del ADN, bien sea directamente, o
indirectamente, por agentes físicos o químicos denominados mutágenos.
2. MUTACIONES ESPONTÁNEAS.
Los principales tipos son:
- Mutaciones puntuales
: sustituciones de pares de bases. Pueden ser:
- transiciones
: suponen cambio de una pareja Pu:Py à
Pu:Py;
- transversiones
: cambio de una pareja Pu:Py à Py:Pu.
- Mutaciones por desplazamiento de la pauta (=fase o marco) de lectura
["frameshift"]. Se deben a:
- eliminación de uno o un corto número de nucleótidos;
- incorporación de uno o un corto número de nucleótidos.
- Grandes delecciones (o borraduras)
.
- Inversiones
- Traslocaciones
.
- Duplicaciones en tándem
- Mutaciones insercionales ocasionadas por elementos genéticos transponibles.
Los estudiaremos a continuación, insistiendo sobre todo en su base
molecular.
2.1 MUTACIONES PUNTUALES
Las transiciones suponen cambios de una pareja purina: pirimida a otra
purina:pirimidina:
A:T ß à
G:C
Las transversiones suponen el cambio de un par purina:pirimidina a una pirimida:purina
(o viceversa):
A:T ß à
T.A
G:C ß à
C:G
2.1.1 BASE
MOLECULAR DE LAS MUTACIONES PUNTUALES
Base molecular de las transiciones
Se deben, en esencia, a la ocurrencia espontánea, durante la replicación, de
formas raras tautoméricas de las bases nitrogenadas. Los desplazamientos tautoméricos
del protón cambian las propiedades de formación de puentes de H, de tal modo que:
forma tautomérica |
Se comporta como |
A* (imino) |
G |
G* (enol) |
A |
C* (imino) |
T |
T* (enol) |
C |
Por lo tanto, los
emparejamientos propiciados por las formas tautoméricas serían:
A* : C
C* : A
T* : G
G* : T
Base molecular de las transversiones
(Modelo de Topal & Fresco:observen en el gráfico los emparejamientos de las
formas sin y anti)
El modelo predice que la frecuencia de mutaciones puntuales en un par de bases
dependerá de:
- constante de equilibrio (k) de
tautomerización del par de bases (unos 10-4 - 10-5);
- frecuencia de dNTPs en forma sin.
(G sin aparece con frec. de 10-1, A , con 5·10-2).
De este modo, teóricamente deberían darse las siguientes frecuencias de mutaciones
puntuales:
- frec. prevista de
transiciones: 10-4 - 10-5
- frec. prevista de
transversiones: 10-5 - 10-6 (para la G) y 5·10-6 - 5·10-7
(para la A)
Sin embargo, en la realidad, las frecuencias observadas son mucho más bajas
(del orden de 10-10). Esto implica que debe de existir un sistema que corrija
los emparejamientos erróneos: como ya sabemos, las ADN polimerasas poseen una capacidad
correctora de pruebas ("editing"): cada paso de elongación es seguido
inmediatamente por una comprobación del emparejamiento. Si este emparejamiento es
erróneo, la polimerasa usa su actividad exonucleasa 3'à
5' para elimininar la base mal emparejada, y a continuación vuelve a polimerizar en
el mismo lugar (por su actividad polimerasa 5'à 3').
Ejemplo: Durante la replicación puede ocurrir que la citosina pase a su forma
imino, que se empareja con la adenina:
- C à Cimino : A (la A es incorporada por la ADN
polimerasa)
- Ahora la Cimino vuelve rápidamente a su forma normal, con lo que queda
- C : A (este emparejamiento anómalo es detectado por la polimerasa)
- La actividad exonucleasa 3'à 5' elimina la A recién
incorporada
- Vuelve a intervenir la actividad polimerasa 5'à 3', que
incorpora G
- El resultado final es el emparejamiento correcto C à G
De esta forma, la tasa real de transiciones a partir de una C es aproximadamente
equivalente al cuadrado de la correspondiente cte. (k) de tautomerización.
Parece ser que en la naturaleza existe una selección natural que propicia una frecuencia
baja, pero no nula, de errores durante la replicación. El significado biológico es
que de esta forma se combina una alta tasa de fidelidad en la replicación, pero con
suficiente flexibilidad (oportunidad de errores) como para generar innovaciones sobre las
que pueda actuar la presión selectiva, lo cual permite evolución.
Puntos calientes de mutación ("hot-spots"): son puntos o zonas dentro
del genomio donde se concentran mutaciones con una frecuencia mayor que la esperada si se
distribuyeran al azar.
Ejemplo: véase el histograma de frecuencias que muestra el
número de mutaciones puntuales en las distintas pares de bases del gen lacI.
Observar que hay una zona especialmente "caliente" cerca de la coordenada 200,
donde la probabilidad de encontrar mutaciones es muy superior a la del resto de la
secuencia.
Explicación: algunas bases, dentro de un determinado contexto
de secuencia, son modificadas químicamente por acción de alguna enzima (normalmente una
metilasa), y ello provoca una mayor susceptibilidad a la aparición de mutaciones
puntuales:
La citosina (C), dentro del contexto de secuencia siguiente:
C C A G G
G G T C C
es metilada por una metilasa específica (que reconoce precisamente a esas dos
citosinas dentro de esa secuencia), para dar 5-metilcitosina. La 5-metil citosina
experimenta espontáneamente una desaminación oxidativa, que la convierte en timina, de
manera que se produce finalmente una transición:
C:G à 5-metil-C:G à T:G
(emparejamiento anómalo)à T:A
2.1.2 CONSECUENCIAS
POSIBLES DE UNA MUTACIÓN PUNTUAL
Si la mutación afecta a una región en 5' que actúa en cis:
Determinadas mutaciones puntuales en el promotor impiden que la
ARN polimerasa se una a esta secuencia; entonces el promotor queda inactivado y no se
produce la expresión de los genes del operón.
En otros casos los efectos son diferentes. Por ejemplo: se recordará
que el promotor del operón lac tiene una secuencia -10 atípica, que obliga a que
la expresión a alto nivel requiera el concurso de la proteína CAP activa. Pues bien, por
medio de mutaciones puntuales se puede lograr que esa secuencia atípica adquiera las
características de las secuencias -10 típicas (a base de TATA, o similar). En este caso,
el efecto de estas mutaciones es que el operón lac se vuelve independiente de la
proteína CAP para su expresión eficiente: el operón se hará independiente de la
represión catabólica.
En los operones sometidos a control negativo, determinadas mutaciones en
el operador provocan una menor afinidad de la proteína reguladora (del represor). El
efecto es el de crear una expresión constitutiva (es decir, el operón se expresa
incluso en presencia del represor activo, debido a que éste no reconoce al operador
mutante).
Si la mutación afecta a una zona codificadora: se produce la
alteración de un codón. Las consecuencias de la alteración pueden ser muy variadas:
- Si la nueva tripleta (codón) codifica el mismo aa. que la antigua (debido a la
sinonimia o "degeneración" del código genético, que afecta sobre todo a la
tercera base del codón) se origina una mutación neutra, que es
"silenciosa" (no hay ningún cambio en el fenotipo).
- Si la nueva tripleta codifica un aa. diferente del original, tenemos varias
posibilidades:
- mutaciones de sentido erróneo o alterado ("missense"):
- si el nuevo aa. es de un tipo químico similar al antiguo, puede cumplir una
función semejante en la proteína mutante, por lo que el fenotipo sería también una mutación
silenciosa por sustitución de aa.
- En otros casos el nuevo aa. provoca una inestabilidad estructural, que puede
reflejarse en que la proteína sea termosensible o criosensible, o más susceptible a
efectores alostéricos. La proteína termosensible es funcional a temperaturas moderadas,
pero se inactiva a temperaturas relativamente altas, a las cuales la correspondiente
proteína silvestre es activa.La proteína criosensible es funcional a temperaturas
moderadas, pero se inactiva a temperaturas relativamente bajas, a las cuales la proteína
silvestre es activa. La proteína más susceptibles a efectores alostéricos es aquella
que se inhibe por efectores de forma más acusada. En esta
categoría entran también las proteínas con actividad residual.
- Por otro lado, podemos encontrar proteínas que pierden su actividad biológica
debido a que la sustitución del aa. provoca la alteración de la estructura secundaria y
terciaria de la proteína: por ejemplo, la aparición por mutación de una prolina en
mitad de una a -hélice destruye esta estructura, y puede
originar inactivación de la función.
- La alteración del centro activo suele provocar inactivación total
o parcial. NOTA:
Aquí se plantea la siguiente pregunta: si la mutación inactiva totalmente la capacidad
funcional de la proteína, ¿cómo podemos reconocer que esa proteína alterada está
presente en la célula? La proteína se puede identificar por medio de anticuerpos (Ac)
obtenidos frente a la proteína silvestre. Si ponemos en contacto estos Ac con un extracto
de las células mutantes, se producirá una reacción antígeno-anticuerpo. Las proteínas
inactivas caracterizadas de esta manera se suelen denominar como "CRM" iniciales
de "cross-reactive material" (material que da reacción cruzada respecto de la
proteína silvestre).
- mutaciones "sin sentido" ("nonsense")
, o sea, aquellas que
cambian un codón original a una de las tres tripletas que significan "señal de
parada" de la traducción:U A G (codón "ámbar"), U A A (codón
"ocre"), U G A (codón "ópalo"). Obviamente, el efecto de estas
mutaciones sin sentido es producir la detención de la lectura del ARNm por parte de los
ribosomas. Por lo tanto se produce una proteína truncada, que suele ser inactiva.
Como ya vimos en el capítulo anterior, si la mutación sin sentido se
produce en un gen de un operón policistrónico, y si esa mutación cae cerca de una zona
del ARNm capaz de formar estructuras secundarias en horquilla, aparte del efecto de
mutación sobre el gen afectado, se detectará un fenómeno de polaridad, debido a
que el acoplamiento transcripción-traducción provoca la no transcripción de la región
situada más allá (en sentido 3') de la zona de la horquilla. O sea, no habrá
transcripción de los genes distales del operón.
2.2 MUTACIONES DE DESPLAZAMIENTO DE LA FASE
(=DEL MARCO O PAUTA) DE LECTURA ["FRAMESHIFTS"]
Se pueden originar por pérdida o ganancia de un pequeño nº de nucleótidos (que no
sea 3 o múltiplo de 3)
Base molecular: Suelen ocurrir en zonas del ADN con secuencias repetitivas. En este
tipo de secuencias, durante la replicación o la recombinación, se pueden producir malos
alineamientos por desplazamiento de una o varias copias de la secuencia repetitiva.
Ejemplo:
G T C C G T C C G T C C G T C C
C A G G C A G G C A G G C A C C
Se produce un cambio total en el sentido del mensaje genético, a
partir del sitio de la mutación se sintetiza una proteína inactiva, a menudo truncada
(debido a que al cambiar la pauta de lectura, pueden aparecer tripletas sin sentido).
Si la pérdida es de 3 nucleótidos (o múltiplo de 3), y la pequeña
delección no afecta a una zona importante de la proteína, se puede producir un producto
que aún tenga actividad biológica.
2.3 GRANDES
DELECCIONES (O BORRADURAS):
Suponen la eliminación de cientos e incluso miles de nucleótidos.
Base molecular: Formación de grandes bucles intracatenarios,
con posterior escisión de dichos bucles. Normalmente en los extremos del material que se
va a delecionar existen secuencias de ADN que son repeticiones directas una de otra, lo
que facilita algún fenómeno de recombinación que lleva a la eliminación del material
(bucle) intercalado entre esas secuencias.
Consecuencias: Mutación irreversible e inactivadora total de
uno o varios genes.
2.4 INVERSIONES:
Cambio de orientación de un segmento de ADN. En muchos casos se deben
a emparejamiento y ulterir recombinación entre secuencias inversamente repetidas en los
extremos del material que sufre la inversión.
Consecuencias: En muchos casos no hay consecuencias
fenotípicas, ya que simplemente se ha invertido el orden de los genes del segmento
invertido en relación al resto del genoma. A diferencia de las deleciones, las
inversiones suelen revertir, precisamente por un nuevo proceso de recombinación
entre las secuencias inversamente repetidas.
2.5 TRANSLOCACIONES:
2.6 DUPLICACIONES EN TÁNDEM
Se trata de la aparición de una copia de una zona de ADN a
continuación de la localización del original. Suelen deberse al emparejamiento y
recombinación entre secuencias similares en dos moléculas de ADN (en realidad, en este
evento, de las dos moléculas de ADN, una se queda con una duplicación mientras que la
otra se queda con una delección).
Si el segmento duplicado es grande y lleva varios genes, no suele
conducir a inactivación génica (ya que aunque en la juntura de la duplicación puede
haber una mezcla de dos genes truncados, sigue habiendo copias silvestres de dichos genes
en el mutante).
Una de las propiedades más características de las duplicaciones en
tándem es su inestabilidad, ya que revierten con gran frecuencia por nueva recombinación
dentro del segmento duplicado.
A pesar de esto, las duplicaciones parecen haber jugado un papel
importante en la evolución. Tras una duplicación que se haya estabilizado, hay dos
copias de uno o varios genes, de modo que una de las copias de cada pareja puede
lentamente ir evolucionando e incluso adquirir una nueva función.
2.7 MUTACIONES ORIGINADAS POR ELEMENTOS GENÉTICOS TRANSPONIBLES
La inserción de una secuencia de inserción (IS) o de un transposón
(Tn) en de un gen origina la inactivación insercional, debida a:
- desplazamientos de la pauta de
lectura, que como antes indicamos, generan frecuentes señales de fin de traducción;
- terminación de transcripción
dependiente de Rho, con efectos polares (debido a que las IS llevan frecuentes señales de
terminación compleja de la transcripción, dependiente de r ).
Una vez que ha ocurrido una inserción de
una IS o de un Tn, pueden producirse ulteriores delecciones secundarias de todo o de parte
del elemento transponible, y a veces también delecciones del material genético adyacente
(fenómenos de escisión imprecisa del IS o Tn).
Por otro lado, dadas dos secuencias IS del mismo tipo, situadas a
cierta distancia una de la otra, por fenómenos de recombinación propiciados por dichas
IS se pueden producir:
- inversiones del material
intercalado entre ambias copias del IS;
- translocaciones del material
intercalado entre esas secuencias de inserción.
3. CARACTERIZACIÓN DE LAS MUTACIONES
Para caracterizar genéticamente una mutación (es decir, para conocer
qué tipo de mutación es) se recurre normalmente a pruebas de reversión de cada
mutante.
- Las mutaciones puntuales
pueden revertir o ser suprimidas por una 2ª mutación (ver más adelante, en este mismo
capítulo).
- Igual ocurre con algunas
mutaciones de desfase de la pauta de lectura.
- Las inserciones sólo pueden
revertir por una delección exacta del material insertado.
- Las delecciones no pueden
revertir.
- Por otro lado, las mutaciones
generadas por elementos genéticos transponibles no aumentan su frecuencia por tratamiento
con agentes mutagénicos, mientras que el resto sí lo hacen.
4. DEMOSTRACIÓN DE LA ESPONTANEIDAD DE LAS
MUTACIONES BACTERIANAS
Uno de los rasgos característicos de las mutaciones es su espontaneidad: surgen
al azar, independientemente de las condiciones ambientales. El efecto del medio ambiente
es seleccionar o no las mutaciones (es decir, favorecer o no el crecimiento diferencial
del fenotipo mutante). De todas formas, más adelante veremos que el medio ambiente puede
alterar la tasa global de aparación de mutaciones.
Durante mucho tiempo se estuvo discutiendo la posibilidad de que las
bacterias tuvieran algún tipo de herencia lamarckiana de caracteres adquiridos (de hecho,
hasta mediados del siglo XX muchos científicos pensaban que las bacterias seguían un
tipo de herencia distinta a la de los organismos superiores, en la que las adaptaciones a
cambios del medio se podían transmitir a la descendencia, al modo lamarckiano). Esta
visión "antropomórfica" de un proceso de evolución "guiada" llevó
a proponer que, por ejemplo, al poner un antibiótico (Ab) en un medio de cultivo, era el
antibiótico el que "inducía" la aparición de mutaciones. Aparentemente, la
observación apoyaba esta postura: si se colocaba un cultivo bacteriano sensible al
antibiótico en presencia de ese antibiótico, al cabo de cierto tiempo, todas las
células del cultivo son resistentes al antibiótico.
Todos estaban de acuerdo en que la mayoría de la población bacteriana
inicial moría al exponerse al agente selectivo (el antibiótico en este ejemplo, o un
fago en otros experimentos), y que el cultivo resistente final procedía del crecimiento
de una pequeña proporción de células resistentes al agente. La disputa estribaba
precisamente en cómo interpretar estos datos de observación. Veamos las posturas
contrapuestas:
- Hipótesis lamarckiana:
cada célula del cultivo inicial tiene una probabilidad pequeña, pero finita, de
sobrevivir al agente selectivo. Una vez que algunas células logran sobrevivir transmiten
este rasgo a su descendencia.
- Hipótesis darwiniana
(denominada "de las mutaciones preexistentes"): ciertas bacterias del
cultivo inicial son ya resistentes al agente antes de ser expuestas a él. El
agente sólo actúa seleccionando las células resistentes y eliminando a las demás
(sensibles).
La polémica fue ganada por los darwinianos ((por supuesto!), debido a unos elegantísimos y
sencillos diseños experimentales:
El primer "golpe de gracia" lo dio la prueba de las
fluctuaciones de Salvador Luria y Max Delbrück (1943): Si las mutaciones a la
resistencia surgieran espontáneamente antes de exponer las bacterias al agente, entonces
diversos cultivos en paralelo en medio líquido deberían de tener su primera mutación a
tiempos distintos. Cuando recogiéramos los cultivos al final del tiempo del experimento y
contáramos las bacterias resistentes, cada cultivo en paralelo debería dar números
variables de resistentes. Veamos el experimento:
- cultivo inicial de una
bacteria sensible a la estreptomicina (StrS).
- Inoculamos muchos tubos en
paralelo, con el mismo n1 de bacterias en cada
uno; los tubos se incuban hasta la fase estacionaria,y se estudian al mismo tiempo final.
de (n-1) tubos sembrar alícuotas de 109
bacterias en placas+estreptomicina |
del tubo restante, sembrar muchas alícuotas de
109 bact. en placas+estreptomicina |
Recuento de colonias StrR |
recuento de colonias StrR |
Resultado: |
resultado: |
Amplias fluctuaciones de colonias derivadas de
los distintos tubos: |
números similares de colonias en las placas
derivadas del mismo tubo: |
30, 10, 40, 45, 183, 12, 173, 23, 173, 23, 57, 63 |
46, 56, 52, 48, 65, 44, 49, 51, 56, 48 |
Media (x) = 62 |
media (x) = 51,4 |
Varianza (v) = 3498 |
varianza (v) = 6,33 |
- en ningún momento los cultivos líquidos estuvieron expuestos al antibiótico;
- todos los cultivos crecieron en idénticas condiciones (tiempo, temperatura, etc.);
- conclusión:
las oscilaciones (fluctuaciones) entre diversos tubos se explican
porque en cada uno de ellos debieron surgir mutaciónes espontáneamente a tiempos
distintos, de modo que los tubos en los que el primer mutante apareció tempranamente
generaron mayor número de colonias resistentes (cada colonia se establece por una célula
descendiente de algún mutante inicial).
Poco más tarde, esta conclusión se afianzó con otro experimento
"clásico": Prueba de la réplica en placa (Lederberg, 1952).
- Supongamos una cepa silvestre de E. coli, que es sensible a la estreptomicina
(StrS).Sembramos masivamente (p. ej. 108 células) en una placa
matriz de un medio sin estreptomicina. Se incuba la placa en estufa a la temperatura
adecuada (37oC). Obtendremos un crecimiento que origina un césped continuo de
bacterias (por crecimiento confluyente).
- Se hace una réplica con un tampón estéril de terciopelo desde la placa matriz a una
placa de medio con estreptomicina. Incubamos en estufa. Se observa que en esta placa ha
habido un crecimiento de una o unas pocas colonias StrR (cada colonia procede
de una célula individual).
- Ahora volvemos a la placa matriz (sin Str) y delimitamos la zona aproximada
"gemela" de aquella que en la placa con Str ha dado la colonia StrR.
Cortamos un cuadradito de agar que incluya esa zona, y recuperamos las células
(resuspendiendo en solución salina estéril).
- A partir de esa suspensión inoculamos 104 células en una nueva placa matriz
sin Str, y dejamos que crezcan. Veremos una multitud de pequeñas colonias casi
confluyentes.
- Repetimos la réplica desde esta 2ª placa matriz a una nueva placa con Str. Tras
incubar veremos un número de colonias StrR mayor que en la 1ª réplica.
- Volvemos a la 2ª placa matriz y repetimos la operación: escogemos un cuadradito que
corresponda a una de las colonias de la placa de réplica, lo cortamos, resuspendemos las
células y sembramos una 3ª placa matriz (sin Str), pero ahora el nº de bacterias que
inoculamos es de unas 100. Incubamos esta placa matriz, y observaremos unas 100 colonias
perfectamente separadas unas de otras.
- Realizamos una 3ª réplica con el tampón de terciopelo a una 3ª placa con Str. Tras
incubar obtenemos un número de colonias más elevado que en la 2ª réplica, y además,
este número se aproxima al de las colonias de la placa matriz correspondiente.
- Reiterando este proceso se logra finalmente que todas las colonias de la placa matriz se
correspondan con las colonias de la placa de réplica correspondiente: es decir, al final,
todas las células son StrR.
Conclusión: Observen que en el experimento hemos realizado una selección
indirecta de las bacterias StrR: siempre vamos tomando células de la placa
matriz (que no tiene presión selectiva del antibiótico) y las pasamos a una placa
selectiva, donde sólo crecen los StrR. La conclusión es clara: las pocas
colonias mutantes StrR detectadas en la 1ª placa de réplica procedieron de un
mismo n1 de células StrR que ya
estaban presentes en la 1ª placa matriz, antes del contacto con el antibiótico. La
reiteración del proceso de selección indirecta va "estrechando el cerco" a las
células resistentes, de manera que al final logramos una placa matriz donde todas las
células son resistentes, descendientes de la primera colonia StrR que
detectamos en la primera fase de réplica.
Pero
después de todo ¿existen mutaciones adaptativas en bacterias?
A finales de los años 80 ciertos experimentos sugirieron la existencia
de ciertas mutaciones que parecían ser adaptativas, surgiendo "después" de ser
sometidas a determinadas condiciones de cultivo. Para tratar este polémico asunto, véase
el documento sobre mutaciones adaptativas, que incluye un
modelo reciente.
5. TASA DE MUTACIÓN
En una población bacteriana se define la tasa de mutación (T) para un
determinado fenotipo como la probabilidad de que una célula mute a ese fenotipo en un
determinado intervalo de tiempo. Luria y Delbrück (1943) escogieron como intervalo de
tiempo unitario el correspondiente a un ciclo celular (o sea, a una generación), que es
el tiempo necesario para completar una ronda de división celular. Por lo tanto:
T = m / d, donde m es el nº de mutaciones surgidas en un
tiempo t, y d es el nº de divisiones ocurridas en ese tiempo t.
Si expresamos d en función del número de células: T= m
/ (N-N0)
NOTA 1: La tasa T de mutación espontánea es constante para
cada división celular a distintas tasas de crecimiento
En la expresión anterior hay que introducir un factor de corrección,
ya que en el momento de determinar el número de células (N), las bacterias se encuentran
en distintas etapas del siguiente ciclo celular, de modo que el promedio real de
divisiones es mayor que N en un factor equivalente a 1/ln 2. Resulta, entonces:
T= m·ln2 /(N-N0) = 0,69·m / (N-N0)
A pesar de lo sencillo de esta fórmula, el cálculo en la práctica de
la tasa de mutación no es tan fácil como ésta parece dar a entender. Ello se debe a que
el parámetro m mide el número de eventos de mutación en un lapso de
tiempo, que no equivale al número de bacterias mutantes medidas. Por lo tanto, y a
pesar de lo fácil que suele ser cuantificar el número de mutantes, en el experimento, en
ese cantidad medida se incluyen los descendientes de eventos más o menos antiguos de
mutación a lo largo de ese experimento. Para calcular m hay que recurrir a ciertos
métodos estadísticos.
Por ejemplo, se puede combinar un experimento de tipo de Luria y
Delbrück con la distribución de Poisson. Imaginemos que sembramos 20 tubos
independientes con la misma cantidad inicial de bacterias sensibles a la estreptomicina e
incubamos el mismo tiempo en las mismas condiciones, de modo que la N-N0 sea
5.6X108; imaginemos que en esa prueba de las fluctuaciones en 11 de los 20
tubos no han surgido mutantes resistentes al antibiótico. De acuerdo con la aproximación
de Poisson a la distribución normal, la probabilidad de tener cero (0) mutaciones en un
cultivo sería:
P0 = m0·e-m/0!
Aplicando esto a nuestro ejemplo:
P0 = 11/20 = 1·e-m/1
Y por lo tanto, podemos despejar y resolver el valor de m = -ln11/20 =
0.59. Ahora podemos calcular la tasa de mutación:
T = 0.6·0.59/5.6X108 = 7.3·10-9
NOTA2: Obsérvese que hemos definido la tasa de mutación respecto de
un fenotipo. Esto significa que aquellos fenotipos que dependan de varios genes
tendrán tasas de mutación superiores a las de aquellos que dependan de un solo gen. Por
ejemplo, la tasa de mutación hacia auxotrofía para la histidina o el triptófano (cuya
biosíntesis depende de varios genes) está en torno a 10-7, mientras que la
tasa de mutación a resistencia a estreptomicina (que, como se recordará, depende de la
alteración del gen de la proteína ribosómica S12) es de sólo 1010 o 1011.
6. REVERSIBILIDAD DE LAS MUTACIONES BACTERIANAS
Las variaciones fenotípicas producidas por las mutaciones
no-silenciosas son transmisibles a la descendencia. Es decir, una vez producido el cambio,
éste es permanente, pero no necesariamente irreversible (como ya dijimos,
solamente las grandes delecciones son irreversibles).
La reversibilidad de las mutaciones suele deberse a una segunda
mutación que restaura el fenotipo original. Esta 2ª mutación puede ser de dos tipos
principales, y varios subtipos:
- Reversión (en sentido
estricto), que restaura el genotipo original. Esto equivale a una retromutación
("back-mutation").
- Supresión: la 2ª
mutación suprime los efectos de la 1ª pero no restaura el genotipo original.
Por lo tanto, tras la mutación supresora, la célula queda con dos mutaciones. La
supresión se clasifica a su vez en:
- Supresión indirecta
: no se corrige el producto del primer gen, pero la 2ª
mutación anula las consecuencias fenotípicas. Ejemplos:
- Se abre una nueva vía para la síntesis del producto afectado por la 1ª mutación.
- El producto mutado de la 2ª mutación puede sustituir al producto de la primera.
- Se provoca un cambio en el medio intracelular, que hace que el producto alterado de la
primera mutación vuelva a ser funcional.
- Supresión directa
: la 2ª mutación corrige el producto del primer gen mutado.
Puede ser de dos tipos principales:
- Supresión intragénica
: la 2ª mutación ocurre en el mismo gen donde ocurrió
la primera.
- Supresión intergénica (= extragénica):
la mutación supresora afecta a otro
gen, que suele ser uno de los genes implicados en la maquinaria de traducción del
ARNm: ARNt y proteínas ribosómicas.
6.1 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTRAGÉNICAS
- Introducción de un desfase de
signo opuesto al de la primera mutación à restauración de
la pauta de lectura alterada por una previa mutación de desfase de lectura
("frameshift"). La única zona alterada tras la mutación supresora sería la
que queda entre ella y la 10 mutación. Si esta
zona es corta y no es esencial para la actividad biológica, se puede restablecer el
fenotipo primitivo.
- Supresiones en el mismo
codón que quedó afectado por la 1ª mutación, de modo que se codifica un
aminoácido distinto del silvestre y distinto del aa. del primer mutante, pero que
restaura la funcionalidad de la proteína. A este tipo de supresión se la denomina
también pseudorreversión.
- Mutación puntual
compensatoria en un sitio distante respecto de la primera mutación: la 2ª mutación
compensa a la 1ª, de modo que se restaura la estructura tridimensional y/o el centro
activo de la proteína.
6.2 BASES MOLECULARES DE LAS SUPRESIONES DIRECTAS INTERGÉNICAS
6.3 EFICACIA DE LAS MUTACIONES SUPRESORAS POR ARNt MUTANTES
Cada supresor tiene una eficacia característica de supresión,
que se refleja en la proporción de cadenas polipeptídicas mutantes que son terminadas de
forma normal (en lugar de quedarse truncadas). Esta eficacia depende, esencialmente de:
- la concentración del ARNt
supresor en la célula;
- afinidad del ARNt supresor
hacia la aminoacil-ARNt-sintetasa;
- afinidad del aa-ARNt por el
ribosoma, en competencia con los factores de terminación de traducción que reconocen el
mismo codón "sin sentido" (de parada de lectura).
La mutación supresora, por sí misma disminuye
la velocidad de crecimiento de la bacteria, debido a que, aparte de sucapacidad
supresora, introduce errores de lectura en los ARNm normales.
Los supresores han de ser, por fuerza, poco eficientes, como
para no hacer que la célula muera por introducción de demasiados errores en la lectura
de los ARNm normales (es decir, la mayor parte de las veces, los supresores introducen el
aminoácido correcto). Pero por otro lado, han de ser suficientemente eficicientes
como para poder introducir aminoácidos en codones mutantes con la frecuencia adecuada
para suprimir la mutación primaria. Normalmente, los supresores típicos suprimen 5-10%
de las veces. Es decir, la mayoría de las veces se introduce el aa. correcto frente al
codón correcto.
7. AGENTES MUTAGÉNICOS E INDUCCIÓN DE MUTACIONES
Anteriormente comentamos que el medio ambiente no induce mutaciones
concretas (p. ej., el antibiótico no provoca la aparición de los mutantes resistentes).
Ahora bien, lo que sí pueden hacer determinadas condiciones ambientales es elevar la
tasa global de aparición de mutaciones.
Determinados agentes ambientales físicos o químicos pueden dañar el
ADN o interferir con la maquinaria replicativa, de modo que provocan una mayor
frecuencia de aparición de mutaciones (y en este sentido hablamos de "mutaciones
inducidas"). A dichos agentes se les llama mutágenos o agentes mutagénicos. Así
pues, en última instancia, los mutágenos causan alguna alteración en el ADN que
- bien no puede ser reparada
convenientemente,
- o bien es un daño tan extenso
que sobrepasa la capacidad de los mecanismos celulares normales de reparación (consultar
el tema de "Mecanismos de Reparación de los daños al ADN").
AGENTES FÍSICOS
Es el mutágeno físico más empleado en el laboratorio para obtener
mutaciones en las bacterias. Como ya estudiamos en su momento, su efecto principal es
originar dímeros de pirimidina intracatenarios (con creación de una anillo ciclobutano
entre dos Py consecutivas). Las proporciones de lesiones son las siguientes:
Las mutaciones aparecen principalmente
como consecuencia del mecanismo posreplicativo de reparación propenso a error (o sea, el
sistema SOS). Con menor frecuencia la luz UV ocasiona hidratación de la C, lo que da
origen a transiciones.
Tienen mayor poder de penetración que los rayos UV, pero son de
difícil manejo, por lo que se emplean poco en bacterias. Los rayos X ocasionan daños
reparables por el sistema SOS.
Las radiaciones ionizantes (p. ej., rayos g
) provocan labilizaciones en el ADN, que terminan en roturas en las hebras del ADN (por
ataque al enlace fosfodiéster), que finalmente pueden conducir a delecciones.
AGENTES QUÍMICOS
Se pueden agrupar en varias categorías:
- Análogos de bases, que se incorporan durante la replicación del ADN.
- Agentes hidroxilantes o desaminantes de las bases nitrogenadas.
- Agentes alquilantes.
- Agentes intercalantes, que se introducen en la doble hélice del ADN, entre pares de
bases consecutivas.
- Bloqueadores del emparejamiento de las bases.
-
Son sustancias con una estructura en anillo similar a las bases
naturales de los ácidos nucleicos, pero con propiedades químicas diferentes. Como
ejemplos tenemos:
- 5-bromouracilo (5-BrU)
- 2-aminopurina (2AP).
Estas moléculas entran a las células y
son convertidas a los correspondientes "dNTP", de modo que su estructura les
permite ser incorporados durante la replicación del ADN.
1) El 5-BrU es análogo de la T. Propicia transiciones T:A à G:C debido a que experimenta frecuentes cambios tautoméricos
desde su forma ceto a su forma enol:
BUceto:Aà BUenol:G
Si partimos de una pareja A=T y en la 1ª ronda de replicación la
ADN-polimerasa introducen un BUceto frente a la adenina, los acontecimientos
hasta llegar a la mutación se pueden resumir así:
A:T à (la primera replicación incorpora
BU) à A:BUceto à
(tautomerización y 2ª replicación) à G:BUenol
à (3ª replicación) à G:C
2) La 2-AP es un análogo de la A. Provoca transiciones A:Tà C:G debido a sus frecuentes tautomerizaciones (APamino
à APimino). Veamos el proceso:
A:T à (primera replicación) à APamino:T à
(tautemerización y 2ª replicación) à APimino:C
à (3ª replicación) à G:C
-
Alteran las Pu o las Py, de modo que:
- causan errores en el
emparejamiento, o bien
- labilizan las bases, de modo
que éstas espontáneamente se modifican químicamente con gran frecuencia.
1) Ácido nitroso: provoca una desaminación
oxidativa de A y C, lo que origina transiciones
sobre C à dU, que se empareja con la A.
sobre A (6-aminopurina) à hipoxantina
(HX) (6-oxopurina), que en su forma ceto se empareja con la citosina:
A:T à HXceto:C à G:C
El nitroso también desamina oxidativamente a la G, pero en este caso
no hay mutación:
G à xantina, que al igual que la G, se
empareja con la C.
2) Hidroxilamina (NH2OH): actúa específicamente
sobre la citosina, añadiéndole un hidroxilo a su grupo -NH2:
-
Introducen radicales alquílicos en una cadena (los alquilantes
monofuncionales) o en las dos cadenas (los bifuncionales) del ADN, produciendo efectos
letales y mutagénicos.
- Los efectos letales fueron
estudiados en el capítulo 19 ("Acción de los agentes químicos").
- Los efectos mutagénicos
dependen sobre todo de la reacción con el O6 de la G.
Algunos agentes alquilantes empleados
en laboratorio:
- gas mostaza: mostazas
nitrogenadas y sulfuradas, como por ejemplo:
- Cl-CH2-CH2-S-CH2-CH2-Cl
: di-(2-cloroetil)-sulfuro.
- etil-etano-sulfonato (EES):
CH3-CH2-SO2-O-CH2-CH3
- etil-metano-sulfonato
(EMS): CH3-SO2-O-CH2-CH3
- nitrosoguanidina (NTG),
que es la N-metil, N'-nitro, N-nitrosoguanidina:
Todos estos agentes, excepto la NTG,
actúan tanto in vivo como in vitro. La NTG sólo actúa in vivo, ya
que su efecto lo ejerce sobre la horquilla de replicación del ADN. La NTG es uno de los
mutágenos más potentes que se conocen, pero es un agente "sucio", en el
sentido de que genera varias mutaciones en la misma célula. Induce reparación SOS
propensa a error, dando origen a transiciones, transversiones y desfases del marco
original del lectura.
Como hemos dicho, estos agentes originan un daño premutagénico
principal consistente en alquilación del O6 de la G. Ello provoca una gran
distorsión en la doble hélice, que posteriormente se plasma en transiciones del tipo
G:C à A:T.
Sin embargo, muchas bacterias poseen un sistema específico para
reparar las lesiones de la O6-alquil-guanina, que funciona de la siguiente
manera:
- La bacteria posee una O6-alquil-glucosilasa, que rompe el enlace
N-glucosídico entre la O6-alquil-guanina y la desoxirribosa. Esto provoca la
creación de un sitio apurínico (sitio AP).
- El sitio AP es reconocido por una endonucleasa correctora (apurinasa), que rompe
el enlace fosfodiéster del lado 5' del sitio apurínico.
- Se produce una reparación por escisión-resíntesis de un pequeño n1 de nucleótidos, pero si el daño es muy grande se
produce una situación SOS que tiende a ser reparada por el sistema propenso a error
ya estudiado, lo que provoca introducción de errores, que conducen a transiciones y
transversiones.
-
Se introducen entre los pares de bases del ADN, dando origen a pérdida
o ganancia de nucleótidos (o sea, generan mutaciones de cambio de la pauta de lectura
del mensaje genético).
Estas sustancias son moléculas planares con 3 o 4 anillos conjugados,
que presentan un cierto parecido con los pares de bases del ADN, pero no se pueden
incorporar covalentemente al esqueleto de éste, sino que se intercalan entre dos pares de
bases consecutivas, con lo que provocan distorsiones de la doble hélice.
Algunos ejemplos:
- derivados de la acridina,
como el naranja de acridina
- bromuro de etidio (ver nota)
- derivados de la flavina
(como la proflavina).
Estabilizan emparejamientos erróneos
durante la replicación y la recombinación del ADN, dando origen a desplazamientos de la
pauta de lectura.
Aplicaciones: Algunos se están ensayando en cuanto a su
capacidad de inhibir tumores cancerígenos, o como antivirásicos, o contra el protozoo
causante de la malaria.
-
Este grupo incluye potentes carcinógenos como:
- benzo-a-pireno
- aflatoxina-B1.
Modifican purinas, provocando grandes
lesiones en el ADN, que inducen el sistema SOS de reparación, lo que finalmente implica
reparación propensa a error.
8. LAS BACTERIAS COMO INDICADORAS DE SUSTANCIAS
MUTAGÉNICAS Y POTENCIALMENTE CARCINOGÉNICAS
Uno de los más claros indicios de que el cáncer surge a menudo como
consecuencia de fenómenos mutagénicos es que la mayoría de los carcinógenos son
también mutágenos.
Ames y sus colaboradores desarrollaron, a finales de los años 70, una
prueba rápida, sencilla y económica por la que se pueden ensayar compuestos como
posibles carcinógenos. Su base consiste precisamente en ver si son mutágenos frente a
bacterias (es decir, se comprueba si tras el tratamiento de un cultivo bacteriano con la
sustancia en cuestión, aumenta la tasa de aparición de mutantes.
TEST DE AMES:
Usa una serie de cepas his- de Salmonella
typhimurium, muy bien caracterizadas a nivel genético-molecular.
- Una suspensión de la bacteria se siembra masivamente (unas 108) en placas
Petri que llevan un medio mímino (MM) -por lo tanto, sin aminoácidos- .
- A continuación, en el centro de la placa se coloca un pequeño disco de papel de filtro
impregnado con la sustancia que se desea ensayar. Acto seguido, las placas se incuban en
estufa a la temperatura óptima de crecimiento de la bacteria (37oC).
- Las placas se sacan de la estufa (a las 24 h., por ejemplo) y se cuentan las colonias
surgidas en cada placa, comparándolas con las colonias de una placa control que no
llevaba la sustancia. Las colonias habrán surgido por el crecimiento de bacterias que
hayan experimentado reversiones (=retromutaciones). Cada reversión en el alelo original his--
restituye el fenotipo silvestre His+, y por lo tanto capacita a la bacteria
a crecer y dividirse en el medio mínimo.
Si la prueba da resultado positivo (o sea, la sustancia induce altas
tasas de mutación sobre la bacteria), es muy probable que el compuesto ensayado sea
también carcinógeno, por lo que habrá que continuar estudiándolo a estos niveles. (El
90% de los compuestos que dan positivo en el Test de Ames se ha demostrado que son
carcinógenos).
Ulteriores mejoras en el test de Ames:
En los últimos años esta prueba ha sido modificada para mejorarla
o adaptarla a situaciones especiales. Veamos algunas de estas modificaciones:
- uso de cepas de Salmonella
defectivas en reparación (uvrA--, uvrB--, uvrC--,
etc). En estas cepas, cualquier daño al ADN no puede ser corregido con total eficiencia.
Esto hace que estas cepas sean más sensibles frente a sustancias con menor potencial
carcinogénico.
- Muchos agentes son mutágenos
en humanos sólo tras su "activación" metabólica por el hígado, pero son
inactivas por sí mismas. Para detectar a estas sustancias, el test de Ames puede
modificarse incorporando un extracto microsomal estéril (fracción libre de células de
hígado animal o de cultivos de tejidos). El extracto microsomal posee oxigenasas que
originan epóxidos a partir de la sustancia a ensayar, y a su vez son estos derivados de
tipo epóxido los que verifican la acción mutagénica.
- Algunas sustancias a ensayar
no entran eficientemente a la bacteria debido al efecto de barrera de la membrana externa
de la pared celular. Para solventar esto, se recurre a emplear mutantes LPS--
de Salmonella (o sea, mutantes alterados en el lipopolisacárido, LPS), que
facilitan la entrada de moléculas hidrofóbicas.
9. ALGUNOS MUTANTES BACTERIANOS EMPLEADOS EN LABORATORIO
9.1 ALGUNOS
CONCEPTOS BASICOS
En este apartado pretendemos realizar una sencilla sinopsis de algunos
tipos de mutaciones que se utilizan con frecuencia en los laboratorios de investigación.
Previamente repasaremos algunos conceptos y términos que son igualmente de uso común en
muchos estudios de genética:
Dependiendo de que la mutación genética se manifieste o no a nivel
fenotípico, y según el grado de afectación fenotípica, podemos clasificar las
mutaciones de la siguiente manera:
- mutaciones silenciosas (o
neutras), si no hay efecto fenotípico;
- mutaciones que implican
alteración del fenotipo silvestre:
- letales: si ocasionan
la muerte o pérdida de viabilidad del microorganismo;
- condicionalmente letales:
si bajo determinadas condiciones el mutante pierde la viabilidad, pero bajo otras la
mantiene.
- mutaciones de alteración
fenotípica que suponen la pérdida o la merma de alguna función que no sea esencial
para la viabilidad del organismo. Dentro de ellos están los mutantes condicionales
(su fenotipo alterado se manifiesta en determinadas circunstancias).
Las mutaciones condicionales (incluidas
las condicionalmente letales) son muy útiles para estudiar aquellos genes esenciales para
la bacteria. En estos mutantes hay que distinguir dos tipos de condiciones:
- condiciones restrictivas
(también llamadas no-permisivas): son aquellas condiciones ambientales bajo las cuales el
mutante pierde la viabilidad, o su fenotipo se ve alterado, debido a que el producto
afectado por la mutación pierde su actividad biológica.
- condiciones permisivas:
son aquellas bajo las cuales el producto del gen mutado es aún funcional.
Algunos ejemplos de mutantes
condicionales muy empleados en genética:
- mutantes sensibles al calor
(termosensibles). Se suelen denominar con las siglas ts. El producto del gen mutado
es más sensible al calor que el producto silvestre
- mutantes de biosíntesis
sensible al calor;
- mutantes sensibles al frío
(criosensibles)
- mutantes sensibles a efectores
alostéricos
- mutantes suprimibles por
supresores extragénicos (por ejemplo, por ARNt supresores, mutantes);
- mutantes dependientes de
estreptomicina (consultar "antibióticos aminoglucósidos", del cap. 20);
- mutantes estabilizados
osmóticamente (sólo son estables en altas concentraciones de sales).
En principio, y "por
definición", es imposible obtener mutantes letales estrictos de genes esenciales
para la viabilidad de la bacteria (p. ej., en genes de la ADN-polimerasa, ARN-polimerasa,
ADN-ligasa, etc.), pero sí es posible conseguir mutantes condicionalmente letales,
especialmente los termosensibles. Por ejemplo, si tras un tratamiento mutagénico
sembramos células de Escherichia coli en placas y las cultivamos a 30ºC, y luego
hacemos réplicas en placas que se incuban a 42ºC, las colonias "ausentes" en
estas últimas nos señalan correspondientes colonias de la placa matriz candidatas a
mutantes termosensibles.
Otro tipo de mutantes condicionales muy empleados en bacterias son
aquellos con mutaciones sin sentido. Como se recordará, cuando el ribosoma llega al
codón sin sentido, se detiene la traducción ulterior. Sin embargo, si esa bacteria tiene
simultáneamente una segunda mutación de tipo supresor extragénico, a saber, un ARNt
mutante adecuado, se puede restablecer el fenotipo silvestre (al menos parcialmente).
9.2 TIPOS
Y EJEMPLOS DE MUTANTES EMPLEADOS EN LABORATORIO
-
Los rasgos culturales de las bacterias son muy fáciles de ver en los
cultivos en placas de Petri, por lo que igualmente es fácil detectar cambios en los
aspectos de las colonias que pudieran deberse a mutaciones. Antes de nada, vamos a
describir brevemente tres tipos de colonias que pueden darse en una misma especie:
- colonias S (lisas): son
circulares, de borde liso o continuo; convexas obtusas (plano-convexas); superficie lisa y
brillante; se dispersan fácilmente en agua, dando suspensiones homogéneas.
- colonias M (mucosas):
son parecidas a las S, pero son convexas más agudas; textura mucosa (al cogerlas con asa
de siembra, se arrastra un "moco").
- colonias R (rugosas): a
menudo presentan un borde ondulado o festoneado; son planas; textura rugosa, y aspecto
mate (no brillante); no se dispersan bien en agua, dando grumos más o menos gruesos.
Pues bien, en muchas especies bacterianas
se pueden estudiar fenómenos de disociación de tipos de colonias en cultivos,
debido a mutaciones que alteran moléculas de las envueltas (p. ej., de la membrana
externa de las bacterias Gram-negativas, de la cápsula, etc.). Veamos algunos ejemplos:
- En algunas bacterias se puede
observar una disociación M à S, que se suele deber a la
pérdida de la capacidad de sintetizar cápsula.
- En algunas bacterias
Gram-positivas la disociación S à R se debe a pérdida de
la cápsula.
- En bacterias Gram-negativas,
las disociación S à R se debe a menudo a la pérdida de la
capacidad de sintetizar las cadenas laterales polisacarídicas del LPS (antígeno
somático "O").
Muchas de estas disociaciones tienen
bastante interés clínico, ya que en bacterias patógenas, el fenotipo mutado (sobre todo
el rugoso) implica la pérdida de propiedades de virulencia y de especificidad
antigénica.
-
En estudios de genética bacteriana (p.
ej., a la hora de elaborar mapas genéticos), es muy habitual recurrir al empleo de mutantes
auxotróficos (es decir, mutantes afectados en algún gen de alguna ruta biosintética
-de aminoácidos, bases nitrogenadas, vitaminas-). Por supuesto, estos mutantes presentan
interés por sí mismos, ya que su estudio permite "diseccionar" la base
genética de las vías metabólicas.
Veamos a continuación un par de maneras de aislar y seleccionar mutantantes
bacterianos auxotrofos:
1) Aislamiento de auxotrofos (sin enriquecimiento):
cultivo original à tratar con mutágeno à lavarà siembra placas de medio mínimo
(MM)+ suplementos nutricionales à réplica a MM
Se comparan las colonias de la placa-matriz (medio con suplementos nutricionales) con
las colonias que hayan aparecido en la placa de réplica (carente de suplementos). La
ausencia de colonia en la placa de réplica en una posición en la que existe colonia en
la placa-matriz incica que la colonia de la placa matriz que no tiene "gemela"
en la réplica es un mutante auxotrófico.
Una vez que sabemos que una colonia es un mutante auxotrófico, hay que determinar qué
requerimiento nutricional le hace falta (es decir, qué compuesto o compuestos no puede
sintetizar debido a la mutación). Para ello se realiza una sencilla prueba en placas de
Petri, denominada auxonograma.
Sin embargo, aun cuando tratemos a un cultivo con un agente mutagénico, la frecuencia
de aparición de un determinado fenotipo mutante es relativamente baja. Esto significa que
en el experimento anterior, tendríamos que sembrar y replicar numerosas placas con
grandes números de colonias, con objeto de alcanzar el umbral de probabilidad para
detectar mutaciones auxotróficas. Para solventar este inconveniente, se suele recurrir a
una modificación del método anterior basada en enriquecer en mutantes auxotrofos el
cultivo tratado con el mutágeno:
2) Enriquecimiento por penicilina para el aislamiento de mutantes auxotróficos
(resumen de un protocolo):
-
cultivo original (bacteria silvestre, prototrofa)
-
tratamiento con el mutágeno
-
mezcla de bacterias muertas (p. ej., el 90% del cultivo inicial) y
-
bacterias vivas, entre ellas unos pocos mutantes de diversos tipos
-
el cultivo se transfiere a un medio líquido rico,
-
para permitir la recuperación y la expresión fenotípica (lag
fenotípico)
-
incubar unas cuantas horas
-
el cultivo se lava y se pasa a un medio líquido mínimo
-
añadir penicilina e incubar
-
la penicilina mata a los prototrofos, pero los auxotrofos no mueren,
porque no crecen en MM (muerte selectiva de los parentales prototrofos)
plaquear en medio sólido rico
-
hacer réplica a medio sólido mímino
-
identificar los auxotrofos (no crecen en MM)
-
recuperar los auxotrofos de las placas de medio rico, y caracterizarlos
(hacer auxonograma)
Los mutantes resistentes a antibióticos surgen por varios tipos de
mecanismos, entre los que se encuentran:
- alteración de algún gen que
codifica una diana (sitio de unión) del antibiótico;
- alteración de algún gen
responsable de permeabilidad al antibiótico.
Los mutantes resistentes a fagos surgen
esencialmente por alteración de receptores de la superficie celular, sobre los que se
adsorben los fagos.
Ambos tipos de mutantes son de muy amplio uso para "marcar"
cepas bacterianas en experimentos de genética (especialmente los que implican algún
proceso de transferencia de material genético desde una estirpe donadora a otra
receptora). Estos marcadores genéticos permiten seleccionar directamente la cepa que los
porte añadiendo al medio de cultivo el correspondiente agente selectivo (antibiótico o
fago), que obviamente mata o inhibe el crecimiento de las cepas sensibles.
-
Estos mutantes pierden la capacidad de metabolizar determinados
sustratos, pero pueden recurrir a otros alternativos. Para aislar estos mutantes se puede
recurrir en muchos casos al uso de medios diferenciales que incorporan indicadores de pH,
que cambian de color en función del uso o no del sustrato en cuestión.
Por ejemplo: si quisiéramos aislar mutantes Lac-- de E.
coli, sembraríamos en Agar Mac Conckey. Los mutantes Lac-- dan colonias
transparentes, mientras que el fenotipo silvestre Lac+ da colonias rojas opacas
con un precipitado alrededor de sales biliares (recordar el uso de este medio en las
prácticas).
10. VARIACIONES BACTERIANAS POR CURACIÓN DE
PLÁSMIDOS
Como ya sabemos, los plásmidos son material genético
extracromosómico que se replican independientemente del cromosoma (replicones
autónomos), y que no son indispensables para la viabilidad de la bacteria que los posee.
Hay plásmidos crípticos que no dan ningún fenotipo detectable (función desconocida),
pero existen muchos plásmidos que codifican funciones como resistencia a antibióticos o
a metales pesados, virulencia a plantas o animales, capacidad de fijar nitrógeno
atmosférico, etc.
Como es lógico, el material genético plasmídico es susceptible de
experimentar mutaciones. Pero la posesión de plásmidos por muchas bacterias puede
condicionar otro tipo de variaciones genotípicas heredables: la curación,
consistente en la pérdida del plásmido, lo que acarrea obviamente la pérdida
concomitante de las funciones y fenotipos codificado por aquel, sin que se afecte la
viabilidad de la bacteria.
Métodos de curación de plásmidos:
- Sometimiento del cultivo
bacteriano a altas temperaturas (cercanas a la temperatura máxima);
- Tratamiento del cultivo con
agentes químicos que se intercalan en el ADN, interfiriendo con la replicación,
estabilidad o reparto del plásmido a las células hijas (bromuro de etido, naranja de
acridina, etc.).
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LIBROS DE TEXTO Y DE CONSULTA:
LEWIN: "Genes" (Ed. Reverté).
Pero es preferibla la 6ª edición en inglés (Ed. Wiley).
STANIER y otros: "Microbiología-2ª edición" (Ed. Reverté,
1988). Muy recomendable todo el cap. 10, con un excelente tratamiento de los tipos de
mutaciones y sus bases moleculares, de la supresión, y de la tasa de mutación. Contiene
una sección sobre metodología para aislar y caracterizar mutaciones.
DAVIS y otros: "Tratado de Microbiología" (4ª edición,
Masson- Salvat).
JIMÉNEZ SÁNCHEZ, A. Y R. GUERRERO (coords.): "Genética
molecular bacteriana". (Ed. Reverté, 1982). Contiene varios capítulos muy
recomendables:cap. 1: "Fidelidad de la expresión génica y base molecular de la
mutación espontánea". Incluye esquemas sobre los emparejamientos entre las formas
tautoméricas de las bases del ADN. Cap. 12: "Mecanismo de la reparación SOS".
Cap. 13: "Utilización de microorganismos en la detección de sustancias con acción
mutagénica y carcinogénica". Describe las bases del test de Ames (y otras pruebas),
y sus mejoras hasta la fecha.
JIMÉNEZ SANCHEZ, A., JIMÉNEZ MARTÍNEZ, J (1998): "Genética
microbiana". Ed. Síntesis.Madrid.
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actualizado el 30 de diciembre de 1998
Ó 1998 ENRIQUE IAÑEZ PAREJA. Prohibida su reproducción, salvo con fines
educativos.
Se agradecen los comentarios y sugerencias. Escríbame a eianez@goliat.ugr.es
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